本文關(guān)鍵詞：幾種有機熒光傳感器的合成及其在內(nèi)源性生物酶和硫醇檢測中的應(yīng)用研究

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【摘要】：近年來,有機熒光傳感器成為化學(xué)、環(huán)境和生物等學(xué)科及其交叉學(xué)科的研究熱點,這是因為有機熒光傳感器具有合成過程簡單、成本低廉、能實現(xiàn)識別手段多樣化等優(yōu)點。而且有機熒光傳感器在測試的過程中操作簡單,樣品不需要進行復(fù)雜的預(yù)處理工序,能對被檢測物進行實時原位檢測,同時還有很好的細(xì)胞膜穿透性,能對活體細(xì)胞和活體組織進行跟蹤成像,因此具有很好的生物應(yīng)用前景。本文通過設(shè)計合成三種基于不同熒光響應(yīng)機理的有機熒光傳感器,分別實現(xiàn)了對人體內(nèi)源性生物酶和小分子生物硫醇的定量檢測和生物成像。首先,我們設(shè)計合成了一種基于激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)機理的堿性磷酸酶(ALP)熒光探針。該探針是由一種黃酮類熒光團上的羥基修飾上磷酸基團制備而成,該磷酸基團具有雙重功能:阻斷熒光團發(fā)生ESIPT效應(yīng)和作為堿性磷酸酶發(fā)生特異性水解反應(yīng)的響應(yīng)基團。當(dāng)磷酸基團存在時,探針分子中羥基被保護起來,因此無法發(fā)生ESIPT效應(yīng),熒光團互變異構(gòu)體的熒光被淬滅,當(dāng)有堿性磷酸酶存在時,磷酸酶催化水解磷酸基團,放出熒光團上的羥基,因此可以實現(xiàn)分子內(nèi)互變異構(gòu),發(fā)出強烈的熒光。該探針體系具有很好選擇性和很低的檢測下限,檢測下限達到了0.032 U/L,并且可以用于實際生物樣品,如血清中堿性磷酸酶的測定。與此同時,我們設(shè)計的探針分子很容易被細(xì)胞攝取,并且具有很低的細(xì)胞毒性,可以對細(xì)胞內(nèi)生的堿性磷酸酶進行生物成像。其次,我們設(shè)計了一種巧妙的比率型熒光傳感體系用于透明質(zhì)酸酶(HAase)檢測,該體系是基于透明質(zhì)酸(HA)誘導(dǎo)的激基締合物發(fā)射,并能對HAase進行靈敏檢測,檢測下限達0.007 U/mL。通過合成正電荷芘衍生物N-Py,利用靜電相互作用的原理使得N-Py與帶負(fù)電荷的透明質(zhì)酸分子結(jié)合形成聚集體系,發(fā)出激基締合物的熒光。當(dāng)HAase加入到傳感體系中,HAase催化水解透明質(zhì)酸生成小片段,破壞了N-Py的激基締合物狀態(tài),形成激發(fā)單體狀態(tài),發(fā)出激發(fā)單體的熒光。這種激基締合物-激發(fā)單體的熒光比率信號轉(zhuǎn)換可以用來檢測HAase含量。探針分子在形成激基締合物后需要可見光激發(fā),紅光發(fā)射,這一性質(zhì)使得體系能較好地消除生物樣品的自熒光干擾,提高檢測的準(zhǔn)確性。同時測試體系還成功被用于人尿液中HAase的檢測,并取得令人滿意的準(zhǔn)確度。該HAase傳感體系的設(shè)計策略可以為其他熒光比率型生物酶傳感器的設(shè)計提供參考和思路。最后,我們將兩種熒光團組合制備出了一種能對硫醇進行特異性響應(yīng)的熒光探針。該探針具有雙硫醇響應(yīng)機制,通過與不同硫醇反應(yīng)后,在不同波長激發(fā)下發(fā)出兩種獨立的近紅外和綠色熒光發(fā)射信號,來同時對GSH和Cys/Hcy進行區(qū)分。該探針是由花菁類熒光團NR-OH與NBD基團通過醚鍵相連得到,連接處即為GSH和Cys/Hcy的響應(yīng)位點。該探針由于存在從NR-OH基團到NBD基團的ICT效應(yīng),因此本身沒有熒光。當(dāng)GSH加入后,探針體系會在716 nm處發(fā)出NR-OH的熒光,而另外一種產(chǎn)物NBD-GSH由于硫原子的淬滅作用而不能發(fā)出熒光。當(dāng)Cys/Hcy加入后,由于這兩種硫醇接上NBD基團后能發(fā)生分子內(nèi)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換,不存在淬滅作用,因此在470和670 nm光激發(fā)下,會發(fā)出兩種獨立的熒光發(fā)射,分別為550和716 nm。這種有區(qū)別的熒光發(fā)射方式可以用來同時區(qū)分GSH和Cys/Hcy。該探針還能應(yīng)用于人血清樣品中硫醇的檢測,在細(xì)胞實驗中表現(xiàn)出很低的細(xì)胞毒性,并且能在復(fù)雜細(xì)胞環(huán)境中進行成像。因此,該探針體系可提供一種有用的方法用于進一步闡明硫醇的生物作用和跟硫醇相關(guān)的疾病病理分析。
【學(xué)位授予單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.3;TP212

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