發(fā)布時間：2017-12-07 19:00

  本文關(guān)鍵詞：基于質(zhì)譜的疾病標記物高靈敏度生物傳感新方法研究

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【摘要】：近年來,生物傳感與生化分析新方法的研究進展,極大地推動了分析化學(xué)與生命科學(xué)的學(xué)科發(fā)展,在分析化學(xué)和生命科學(xué)的交叉領(lǐng)域,無論在科學(xué)研究方面還是實際應(yīng)用都發(fā)揮著越來越重要的作用。質(zhì)譜技術(shù)是近些年來發(fā)展迅速的生物分析技術(shù)之一。質(zhì)譜作為生物活性分子的檢測手段,具有多種優(yōu)點:高靈敏度,可測定納摩爾以下物質(zhì)的量;快速,數(shù)分鐘內(nèi)即可完成測試;能同時提供精確分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息;既可以定性分析,也可以用于定量分析;有效地與各種色譜分離技術(shù)聯(lián)用。質(zhì)譜的特點可以概括為靈敏、快速、專一、高通量,充分展示了質(zhì)譜比其它方法優(yōu)越。本論文以質(zhì)譜為研究平臺,建立了多種生物傳感新方法。以具有重要生物功能和研究意義以及重大疾病相關(guān)的生物標志物為研究對象,發(fā)展了一系列簡單、快速、成本低、穩(wěn)定性好,且具有高靈敏度、高選擇性和高通量的新型生物傳感方法。研究論文的主要內(nèi)容如下:第2章提出了DNA目標序列碎片化質(zhì)譜檢測DNA甲基化水平的方法。無需經(jīng)過鏈擴增方法,將目標DNA鏈水解后釋放出單個堿基,單個堿基的質(zhì)譜靈敏度遠高于DNA鏈的質(zhì)譜靈敏度。納升電噴霧離子源(Nano ESI)的流速遠低于毫升/分鐘,離子化效率同時得到大大提高。結(jié)合Nano ESI,DNA水解物由流動注射直接進樣并質(zhì)譜檢測,5-甲基胞嘧啶(5m C)的檢出限達0.11 p M。采用經(jīng)濟的甲酸水解法,水解效率高,便于實現(xiàn)。DNA水解物混合溶液無需經(jīng)過色譜分離即可高靈敏度檢測,實驗操作過程簡單,快捷。以前列腺癌相關(guān)基因的Cp G島特定序列為研究對象,通過質(zhì)譜準確測定了20個臨床組織樣本的甲基化水平。第3章將目標序列碎片化質(zhì)譜檢測的方法應(yīng)用到DNA重復(fù)序列拷貝數(shù)的檢測中。重復(fù)序列的動態(tài)突變不僅可以發(fā)生在上代的生殖細胞中從而遺傳至下一代,也可在當代的體細胞中發(fā)生突變。研究已發(fā)現(xiàn),重復(fù)序列的動態(tài)突變與多種神經(jīng)性疾病相關(guān),是當前研究熱點之一。利用PCR擴增方法提高目標重復(fù)序列的濃度,PCR引物上標記生物素。鏈霉親和素磁珠與PCR產(chǎn)物中的生物素結(jié)合,目標重復(fù)序列被磁珠捕獲純化。隨后,目標重復(fù)序列從磁珠上釋放下來,甲酸水解。得到的水解物以質(zhì)譜檢測,胞嘧啶堿基的檢測限為18.23 f M。測定單個CAG拷貝數(shù)時,所需基因組DNA最小量為0.07μg,完全滿足臨床檢測要求。第4章以脂質(zhì)體納米粒子對蛋白質(zhì)疾病標記物進行標記,實現(xiàn)蛋白質(zhì)的高靈敏度免疫質(zhì)譜檢測。蛋白質(zhì)疾病標記物在臨床醫(yī)學(xué)上具有非常重要的作用,是指示疾病發(fā)生、疾病狀態(tài)以及疾病變化的重要指標。但是一些蛋白質(zhì)含量非常低,特別是在血液、尿液等基質(zhì)復(fù)雜的樣品中,檢測難度大。磷脂酰膽堿類磷脂易于電離,質(zhì)譜靈敏度高。將其制備成脂質(zhì)體,并對目標蛋白質(zhì)進行標記編碼,不僅可以對目標蛋白進行信號放大,也可以同時檢測多組分目標蛋白質(zhì)。通過磁珠捕獲臨床樣本中待測蛋白質(zhì),并加入已標記檢測抗體的脂質(zhì)體,得到免疫夾心復(fù)合物。無需移去磁珠,以基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF)直接檢測磁珠上的脂質(zhì)體,從而得知目標蛋白質(zhì)的濃度。前列腺特異性抗原(PSA)與癌胚抗原(CEA)的檢出限分別為0.03 ng/m L和0.2 ng/m L,能夠有效區(qū)分臨床正常值與異常值,在臨床樣本的檢測中也證實了方法的可行性。質(zhì)譜提供的精確質(zhì)量數(shù)提高了對蛋白質(zhì)的鑒定能力,避免了酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)所存在的假陽性結(jié)果。第5章開發(fā)了目標核酸的超靈敏質(zhì)譜計數(shù)檢測方法。在疾病癥狀尚未出現(xiàn)前,人體中已存在極微量的核酸生物標記物,是臨床上極為重要的診斷指標。但是,現(xiàn)有的分析方法難以檢測到超低含量的核酸標記物�？梢�,建立超靈敏的核酸檢測方法顯得尤為迫切以及重要。脂質(zhì)體具有信號放大功能,單個脂質(zhì)體產(chǎn)生一個質(zhì)譜信號峰。磁珠捕獲目標核酸后,利用脂質(zhì)體對目標核酸進行標記,一個脂質(zhì)體對應(yīng)一條核酸鏈。光照條件下,捕獲鏈上的光裂解基團發(fā)生斷裂,脂質(zhì)體從磁珠上釋放出來。利用質(zhì)譜對脂質(zhì)體進行計數(shù)分析,進而得知目標核酸鏈的數(shù)量。所建立的方法實現(xiàn)了單分子水平核酸鏈(10-18 M)的檢測,可以應(yīng)用到超低含量核酸生物標記物的檢測。文中檢測了臨床樣本中丙肝(HCV)病毒的RNA拷貝數(shù)。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：O657.63;TP212.3

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