【摘要】：生物傳感器作為快速靈敏檢測(cè)生物分子的工具一直以來(lái)都是生命科學(xué)和分析化學(xué)領(lǐng)域十分關(guān)注的課題。光學(xué)傳感技術(shù)因具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需分離、可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于生物分子的檢測(cè),如酶活性、蛋白質(zhì)、核酸和生物小分子等。此外,核酸探針因其序列多變、識(shí)別多樣化、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)在生物傳感與生化分析新方法建立方面引起了廣泛的關(guān)注。在大量文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上,本論文結(jié)合多種構(gòu)型的核酸探針和光學(xué)分析方法構(gòu)建了幾種光學(xué)生物傳感新方法用于檢測(cè)聚核苷酸激酶(PNK)活性,mi RNA以及與致病基因相關(guān)的DNA序列。與傳統(tǒng)方法比較,本論文所建立的傳感策略操作簡(jiǎn)便,靈敏度高,檢測(cè)成本低,可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)測(cè)定。具體工作內(nèi)容如下:在第二章中,通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)依賴于磷酸化的DNA連接反應(yīng),我們構(gòu)建了一種無(wú)標(biāo)記的生物發(fā)光傳感器用于PNK活性的檢測(cè)。在該傳感策略中,設(shè)計(jì)了兩個(gè)帶有5’突出端的發(fā)夾DNA探針作為磷酸化受體,同時(shí)廣泛應(yīng)用的磷酸供體ATP被d CTP取代。當(dāng)不存在PNK時(shí),由于發(fā)夾探針5’端缺乏磷酸基團(tuán)而不能引發(fā)連接反應(yīng),顯示出較弱的背景信號(hào)。加入PNK時(shí),使兩探針發(fā)生磷酸化而引發(fā)連接反應(yīng),同時(shí)釋放出AMP,隨后將AMP轉(zhuǎn)換為ATP,在熒光素酶作用下產(chǎn)生明顯的生物發(fā)光信號(hào),通過(guò)生物發(fā)光信號(hào)的連續(xù)監(jiān)測(cè)可實(shí)現(xiàn)PNK活性的實(shí)時(shí)檢測(cè)。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便,無(wú)需標(biāo)記,成本低廉,免受生物基質(zhì)自身熒光的干擾,還可以進(jìn)一步用于PNK的定量、動(dòng)力學(xué)及抑制劑研究。在第三章中,我們基于目標(biāo)分子引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)輔助的連接反應(yīng),通過(guò)生物發(fā)光法檢測(cè)連接反應(yīng)釋放出的AMP,發(fā)展了一種新的高靈敏的mi RNA均相檢測(cè)方法。當(dāng)存在靶mi RNA時(shí),它可有效的引發(fā)兩發(fā)夾探針之間的HCR,形成帶有切口的長(zhǎng)鏈DNA聚合物,這些切口可被連接酶共價(jià)連接,釋放出AMP產(chǎn)生發(fā)光信號(hào),從而實(shí)現(xiàn)mi RNA的定量分析。HCR的引入不僅提高了檢測(cè)的靈敏度,而且通過(guò)核酸探針的特殊設(shè)計(jì)可為其它生物分子的檢測(cè)提供潛在平臺(tái)。重要的是,生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)以靶依賴連接副產(chǎn)物AMP轉(zhuǎn)換的ATP作為報(bào)告基團(tuán),無(wú)需復(fù)雜的熒光素酶標(biāo)記、固定、分離等步驟。該方法具有操作簡(jiǎn)單,成本低廉,高通量,高靈敏等優(yōu)點(diǎn),在實(shí)際檢測(cè)中有很大的應(yīng)用價(jià)值。在第四章中,將納米金的重力和聚合酶的識(shí)別作用相結(jié)合,構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單的熒光傳感方法用于靶DNA序列檢測(cè),并選用與致病基因相關(guān)的p53序列為模型。首先,將巰基修飾的引物通過(guò)S-Au自組裝到Au NP上,當(dāng)存在目標(biāo)DNA時(shí),探針與目標(biāo)DNA的部分序列雜交,生成的不對(duì)稱產(chǎn)物在Taq DNA聚合酶和d NTPs的輔助下,延伸形成穩(wěn)定的ds DNA螺旋結(jié)構(gòu)。最后,在連接酶的作用下將其與帶有熒光分子的ds FAM連接,離心后在沉淀中可以觀察到明顯的熒光信號(hào),而上清液中的信號(hào)基本可以忽略。作為對(duì)照,當(dāng)目標(biāo)DNA序列中存在單堿基錯(cuò)配或?yàn)槿我庑蛄袝r(shí),則不能發(fā)生雜交、延伸、連接反應(yīng),從而使沉淀中基本無(wú)明顯熒光信號(hào)。該檢測(cè)方法不僅具有操作簡(jiǎn)便,響應(yīng)快,選擇性高的優(yōu)點(diǎn),而且還可用于相關(guān)酶活性的檢測(cè)。
【學(xué)位授予單位】：西北師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：O657.3;TP212.3
【圖文】：

生物傳感器的工作原理圖

速度快、分析靈敏度高、選擇性高、抗電子干擾強(qiáng)等特點(diǎn)被廣泛生物分析中。其主要是通過(guò)將待測(cè)物質(zhì)與識(shí)別單元結(jié)合過(guò)程中產(chǎn)號(hào)，通過(guò)換能器轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào), 再經(jīng)放大處理獲得最終的輸出信號(hào)目標(biāo)的定性和定量分析，工作原理如圖 1.2 所示。

種靈敏檢測(cè) T4 PNK 活性及其抑制劑的方法，如圖 1.3B 所示�；跐L環(huán)擴(kuò)增的熒光核酸測(cè)定技術(shù)也得到了不斷的發(fā)展。Liu 等人[22]以 SYBR Green I 作為熒光指示劑，結(jié)合 T4 RNA ligase 2 能夠特異性區(qū)分單核苷酸多態(tài)性、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)發(fā)展了一種靈敏度高、選擇性高的 miRNA 分析檢測(cè)方法，如圖 1.3C所示。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號(hào)：2778497