【摘要】 抗生素是人類在醫(yī)藥領(lǐng)域取得的最偉大成就之一,對(duì)人類健康水平的提高和生命安全的保障起到了極其重要的作用。然而,目前國(guó)內(nèi)外抗生素濫用的問題十分突出,導(dǎo)致耐藥菌急劇增多,藥害事件不斷發(fā)生,對(duì)處于生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的兒童影響尤為突出。四平市婦嬰醫(yī)院是四平市唯一兒童�？漆t(yī)院,其抗生素應(yīng)用情況具有代表性,并且呼吸系統(tǒng)感染是兒童常見病和多發(fā)病,也是抗生素應(yīng)用頻率高、種類多的疾病,因此我們對(duì)四平市婦嬰醫(yī)院2002-2005年呼吸系統(tǒng)感染住院兒童抗生素應(yīng)用狀況進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查分析,以明確該地區(qū)抗生素使用不合理的原因和環(huán)節(jié);同時(shí)對(duì)四平市婦嬰醫(yī)院2004年12月至2005年6月期間呼吸系統(tǒng)感染患兒葡萄球菌的檢出率及耐藥性進(jìn)行研究,運(yùn)用EXCEL軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,分析未應(yīng)用抗生素及應(yīng)用抗生素兩組葡萄球菌的檢出率及耐藥性是否存在差異,繪制兩組葡萄球菌的耐藥趨勢(shì)圖,為兒科細(xì)菌耐藥性研究提供依據(jù),為臨床合理使用抗生素提供參考;并用分子生物學(xué)方法分析葡萄球菌耐藥的遺傳機(jī)制,為四平地區(qū)呼吸系統(tǒng)感染兒童所攜帶的葡萄球菌的分子流行病學(xué)研究提供資料。本論文的主要內(nèi)容包括:1.2002-2005年四平市婦嬰醫(yī)院兒科呼吸道感染抗生素應(yīng)用狀況調(diào)查及分析2.抗生素應(yīng)用對(duì)葡萄球菌耐藥性的影響3.Sul1及aph(3’)-III基因的檢測(cè) 

第一篇 2002－2005年四平市婦嬰醫(yī)院兒科呼吸道感染抗生素應(yīng)用狀況調(diào)查及分析 

在我國(guó)，小兒呼吸道感染是兒科常見病和多發(fā)病，且抗生素的使用率極高，為明確四平地區(qū)兒科呼吸道感染疾病抗生素的應(yīng)用現(xiàn)狀及存在的問題,對(duì)2002年1月至2005年12月四平地區(qū)呼吸科住院兒童抗生素應(yīng)用情況作回顧性調(diào)查分析。 

一、資料與方法 

1．資料 分別隨機(jī)抽取2002、2003、2004、2005年呼吸科住院兒童病例各300份。 

2．方法 統(tǒng)計(jì)抗生素應(yīng)用種類、應(yīng)用頻率、用藥總量、實(shí)際用藥天數(shù)、約定日劑量（DDD）、藥物利用指數(shù)（DUI）、平均住院天數(shù)、抗生素的聯(lián)合應(yīng)用情況、細(xì)菌檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果。約定日劑量（define daily dose，DDD）是WHO藥物利用研究組推薦的測(cè)定藥物利用的單位，DDD值由《兒科臨床藥物手冊(cè)》常用日劑量確定，DDDs（總DDD數(shù)）=用藥總量/該藥的DDD值，DUI是Ghodse教授提出的藥物利用指數(shù)（drug utilization index，DUI），DUI≤1即為合理，DUI=DDDs/實(shí)際用藥天數(shù)。根據(jù)上述數(shù)據(jù)分析抗生素應(yīng)用的狀況、趨勢(shì)及合理性。 

二、結(jié)果 

1．2002－2005年四平地區(qū)呼吸科住院兒童抗生素應(yīng)用率均為100％。 

2．2002－2005 年抗生素應(yīng)用種類、應(yīng)用頻率、用藥總量、實(shí)際用藥天數(shù)、約定日劑量（DDD）、藥物利用指數(shù)（DUI）分別見表1、2、3、4。 

3．2002－2005 年四平地區(qū)呼吸科住院兒童抗生素應(yīng)用頻率的分布：見圖 1、2、3、4。 

4．2002－2005年四平地區(qū)呼吸科住院兒童抗生素應(yīng)用狀況的對(duì)比分析（見表和圖5）：近四年，該地區(qū)青霉素類抗生素的應(yīng)用率低，并呈逐年下降趨勢(shì)；青霉素/酶抑制劑類抗生素在 2003 年開始應(yīng)用，應(yīng)用率逐年降低；四年間，頭孢一代抗生素的應(yīng)用率均最低；頭孢三代抗生素的應(yīng)用頻率均穩(wěn)居首位，且遠(yuǎn)高于其他常用抗生素，頭孢二代抗生素的應(yīng)用率均處于第二位，且應(yīng)用率較穩(wěn)定；隨著 2004 年頭孢三代/酶抑制劑投入該地區(qū)兒科臨床，頭孢三代抗生素的使用率呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。 

5．平均住院天數(shù)及抗生素的聯(lián)合應(yīng)用狀況：2002年四平地區(qū)呼吸科住院兒童平均住院天數(shù)7.09d，最少2d，最多15d，單用一種抗生素219例，占 73％，住院期間聯(lián)合或先后應(yīng)用兩種抗生素54例，占 18％，三種抗生素 24 例，占 8％，四種抗生素 3 例，占 1％；2003年平均住院天數(shù)5.2d，最少2d，最多15d，單用一種抗生素219例，占73％，住院期間聯(lián)合或先后應(yīng)用兩種抗生素72例，占24％，三種抗生素9例，占3％；2004年平均住院天數(shù)4.11d，最少 2d，最多 13d，單用一種抗生素 237 例，占 79％，兩種抗生素51 例，占 17％，三種抗生素 12 例，占 4％；2005 年平均住院天數(shù)6.2d，最少2d，最多16d，單用一種抗生素195例，占65％，兩種抗生素 75 例，占 25％，三種抗生素 21 例，占 7％，四種抗生素3例，占1％，五種抗生素6例，占2％。

6．細(xì)菌檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果：調(diào)查2002－2005年的1200份呼吸科住院兒童病例均未提檢病原體及藥敏試驗(yàn)報(bào)告單。 

第二篇   抗生素應(yīng)用對(duì)葡萄球菌耐藥性的影響  

為深入了解兒科抗生素的應(yīng)用對(duì)葡萄球菌耐藥性的影響，對(duì)四平市婦嬰醫(yī)院2004年12月至2005年6月期間呼吸系統(tǒng)感染患兒葡萄球菌的檢出率及耐藥性進(jìn)行調(diào)查研究，運(yùn)用 EXCEL 軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分析未應(yīng)用抗生素及應(yīng)用抗生素兩組葡萄球菌的檢出率及耐藥性是否存在差異，繪制兩組葡萄球菌的耐藥趨勢(shì)圖，為兒科細(xì)菌耐藥性研究提供依據(jù)，同時(shí)為臨床兒科正確使用抗生素提供第一手資料。 

一、材料及方法 

（一）標(biāo)本的來源     

四平市婦嬰醫(yī)院2004年12月至2005年6月期間呼吸系統(tǒng)感染，但尚未應(yīng)用抗生素的門診患兒的標(biāo)本 250 例，上述時(shí)間內(nèi)，呼吸科住院并應(yīng)用抗生素治療達(dá)三天以上的患兒390例。 

（二）標(biāo)本采集、菌株分離、鑒定及藥敏試驗(yàn) 

1.培養(yǎng)基：普通營(yíng)養(yǎng)肉湯、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、M-H瓊脂等均購(gòu)自杭州天和生物制品公司。 

2.生化試劑：甘露醇發(fā)酵管購(gòu)自杭州天和生物制品公司，兔血漿由本室制備。 

3.主要實(shí)驗(yàn)儀器： SW-CJ-IF凈化工作臺(tái)  蘇州集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司 顯微鏡 Nikon ALPHAPHOT-2 YS2 中國(guó) ES-60J電子分析天平      沈陽(yáng)龍騰電子稱量?jī)x器有限公司 電熱恒溫培養(yǎng)箱 HG303-5                南京實(shí)驗(yàn)儀器廠 

4.藥敏紙片：青霉素 G、苯唑西林、氨芐西林/舒巴坦鈉、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢哌酮、克林霉素、紅霉素、萬(wàn)古霉素、慶大霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、新諾明，購(gòu)自杭州天和生物制品公司。 

5.質(zhì)控菌：金黃色葡萄球菌ATCC25923 

6.標(biāo)本采集 （1）咽拭子：消毒棉簽適度用力擦拭咽后壁和扁桃體部位，然后迅速放入內(nèi)裝3－5毫升無(wú)菌運(yùn)送液的試管中（運(yùn)送液為無(wú)菌的普通營(yíng)養(yǎng)肉湯），在靠近頂端處折斷棉簽桿，塞緊瓶塞。 

（2）菌株分離及鑒定 將所取標(biāo)本劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃培養(yǎng) 18－24 小時(shí)，挑取單個(gè)可疑菌落革蘭氏染色，然后接種于甘露醇發(fā)酵管，最后結(jié)合血漿凝固酶試驗(yàn)將其鑒定至凝固酶陰性及陽(yáng)性葡萄球菌。 

（3）藥敏試驗(yàn)：具體方法及結(jié)果判定嚴(yán)格參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（NCCLS）1999年制定的《藥片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)操作方法》。方法：用接種環(huán)挑取4－5個(gè)菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)4－6小時(shí)，然后用生理鹽水稀釋培養(yǎng)液，使其濁度至0.5號(hào)麥?zhǔn)媳葷峁�，充分混勻后用無(wú)菌棉簽蘸取上述肉湯培養(yǎng)基，在管壁上擠壓，去除多余的液體，均勻涂于 M-H 瓊脂平板表面，在室溫下干燥 5 分鐘，用無(wú)菌鑷子以無(wú)菌操作取出含藥紙片貼在涂有細(xì)菌的平板上，輕輕按壓，以保證紙片與培養(yǎng)基牢固接觸，將平皿置37℃恒溫箱培養(yǎng)16－18小時(shí)。結(jié)果判定：觀察藥敏紙片周圍有無(wú)抑菌環(huán)，量取其直徑（包括紙片直徑）大小，用毫米數(shù)記錄，按抑菌環(huán)直徑的大小報(bào)告敏感、中度敏感和耐藥。 

二、結(jié)果與分析 

1.未應(yīng)用抗生素組250例檢出葡萄球菌49株，檢出率19.6％，金黃色葡萄球菌17株（17/49，34.69％），其中MRSA16株（16/49，32.65％）；凝固酶陰性葡萄球菌 32 株（32/49，65.31％），均為MRCNS（32/49，65.31％）。應(yīng)用抗生素組 390 例檢出葡萄球菌 83株，檢出率 21.28％，金黃色葡萄球菌 7 株（7/83，8.43％），均為MRSA（7/83，8.43％）；凝固酶陰性葡萄球菌 76株（76/83，91.57％），其中 MRCNS70 株（70/83，84.34％）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組菌株葡萄球菌、MRSA與MRCNS的分離率無(wú)顯著差異（P＞0.05）。 

2.兩組菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表 6、7； 對(duì) 13 種抗生素的耐藥率、中介率、敏感率分布見圖6、7；耐藥分布趨勢(shì)見圖8。 3.兩組菌株對(duì) 13 種抗生素的耐藥率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理除苯唑西林（P＜0.01）外均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。 

第三篇Sul1及aph(3')-III基因的檢測(cè)┅┅30 

一、材料與方法┅┅┅30 

二、結(jié)果┅┅┅┅ 30 

三、討論┅┅┅┅┅  33 

結(jié)  論 ┅┅┅┅  35 

第三篇  Sul1 及 aph(3')-III 基因的檢測(cè)                                                              

一、材料與方法 

1.來源 

上述實(shí)驗(yàn)檢出的耐復(fù)方新諾明葡萄球菌 104 株，耐慶大霉素葡萄球菌44株。 

2.引物 

由上海生物工程公司合成2對(duì)引物，參見Sara等人報(bào)道設(shè)計(jì)的擴(kuò)增Sul1基因的引物，序列為P1：5'－CTTCGATGAGAGCCGCGCGC-3'、P2：5'－GCAAGGCGGAAACCCGCGCC-3',擴(kuò)增的片段為436bp[44]；參見糜祖煌等人報(bào)道設(shè)計(jì)的擴(kuò)增aph(3')-III基因的引物，序列為P1：5'－GCCGATGTGGATTGCGAAAA-3'、P2：5'－GCTTGATCCCCAGTAAGTCA -3'，擴(kuò)增的片斷292bp[。 

3.主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 

普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂                 杭州天和生物制品公司 

TaqDNA聚合酶                 北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心 

dNTPs                        北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心 

瓊脂糖                        Spain 

2000bpDNA Marker              北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心 

500 bpDNA Marker               北京鼎國(guó)生物技術(shù)發(fā)展中心 

三用恒溫水浴箱 SHH-W21Y420  北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠 

TGL-16B  低溫離心機(jī)           中國(guó)上海安亭科學(xué)儀器廠  

Gne AmpRPCR System 2700        Applied Biosystem USA    

DY-WZ電泳儀                    北京生化儀器廠 

DYY-III型水平電泳槽            北京市六一儀器廠

UV WHITE –2020D 凝膠成像分析系統(tǒng)        美國(guó) 

4.相關(guān)試劑的配制    

50×TAE:          242g          Tris堿， 

57.1ml        冰乙酸， 

100ml         0.5mol/LEDTA(PH=8.0)                     

1000ml        蒸餾水   

溴酚蘭指示劑：10ml 溶液中含有:                   

100%甘油               5ml                       

0.5mol/L EDTA(pH=8.0)   2.5ml                       

10% SDS                1ml                       

溴酚蘭                  5mg                       

二甲苯胺                5mg                       

蒸餾水                  1.5ml 

結(jié)    論  

1.四平地區(qū)呼吸科住院兒童100%應(yīng)用抗生素,且抗生素品種單一，主要追求高價(jià)位、高檔次的頭孢二代及三代抗生素，選用及換用抗生素不以細(xì)菌檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，靠經(jīng)驗(yàn)用藥，少數(shù)病例無(wú)明確指征頻繁更換抗生素，一些常用抗生素應(yīng)用過量。 

2.兩組葡萄球菌對(duì)青霉素和苯唑西林表現(xiàn)高度耐藥，而對(duì)AMP/SBT敏感性較高，因此青霉素和苯唑西林單獨(dú)應(yīng)用對(duì)葡萄球菌引起的感染失去治療意義，必要時(shí)可根據(jù)聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果與其他抗生素聯(lián)用，AMP/SBT抗葡萄球菌作用肯定，可廣泛用于兒科葡萄球菌感染性疾病。 

3.兩組葡萄球菌對(duì)第一代頭孢菌素的敏感率均高于第二代及第三代頭孢菌素，因此臨床治療葡萄球菌感染，第一代頭孢菌素優(yōu)于第二代及第三代頭孢菌素。 

4.未應(yīng)用抗生素組及應(yīng)用抗生素組葡萄球菌對(duì)對(duì)紅霉素耐藥率較高，臨床可將紅霉素與其他敏感且與之有協(xié)同作用的抗生素聯(lián)用。 

5.兩組菌株慶大霉素的敏感率高，臨床可適當(dāng)選用，但要嚴(yán)格按兒科規(guī)定劑量用藥。 

6.兩組葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感率高，抗葡萄球菌療效顯著，但萬(wàn)古霉素具有耳、腎毒性、靜脈滴注相關(guān)性不良反應(yīng)及血液系統(tǒng)毒性不良反應(yīng)，因此通常不作為兒科一線藥物應(yīng)用, 只有在常用抗菌藥物無(wú)效或不能應(yīng)用( 如青霉素過敏) 時(shí)使用。 

7.兩組葡萄球菌對(duì)13種抗生素的耐藥分布趨勢(shì)相似，耐藥性無(wú)顯著差異，說明該地區(qū)可能存在細(xì)菌耐藥性迅速播散。 

8.四平地區(qū)葡萄球菌磺胺類藥物耐藥不是由Sul1基因編碼控制的。

9.aph(3')-III基因是四平地區(qū)葡萄球菌耐氨基糖苷類抗生素的主要遺傳因素。
 

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