口腔白斑及鱗癌中PCNA、p27、PTEN基因的表達(dá)
【摘要】 （一）中文摘要【目的】通過(guò)免疫組化二步法研究PCNA、p27、PTEN蛋白在人口腔正常黏膜、白斑、鱗狀細(xì)胞癌及大鼠口腔正常黏膜、增生組織、鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)變化，探討PCNA、p27、PTEN蛋白在口腔正常黏膜、癌前病變、鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用并將其表達(dá)情況與大鼠癌變模型中PCNA、p27蛋白的表達(dá)情況比較，為臨床上檢測(cè)口腔白斑癌變提供分子學(xué)上的依據(jù)，為抑癌藥物在臨床中的應(yīng)用，提供參考�！痉椒ā�1.采用免疫組化二步法檢測(cè)10例正�？谇火つ�、15例單純?cè)錾装摺?0例不典型增生白斑、20例鱗癌中PCNA、p27、PTEN蛋白表達(dá)情況并通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2.采用免疫組化二步法檢測(cè)大鼠癌變模型中10例大鼠正常口腔黏膜、10例單純?cè)錾つぁ?5例異常增生黏膜、15例鱗癌中PCNA、p27蛋白的表達(dá)情況,并通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。【結(jié)果】1.PCNA蛋白在人口腔正常黏膜、單純?cè)錾装摺⒉坏湫驮錾装呒镑[狀細(xì)胞癌中的表達(dá)量逐漸增加，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，口腔正常粘膜及單純?cè)錾装�、不典型增生白斑、鱗狀細(xì)胞癌組織中PCNA蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2.p27、PTEN蛋白在人口腔正常黏膜、單純?cè)錾装�、不典型增生白斑及鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)量逐漸降低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，口腔正常粘膜及單純?cè)錾装摺⒉坏湫驮錾装�、鱗狀細(xì)胞癌組織中p27、PTEN蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。3.PCNA、p27、PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性：利用Spearman統(tǒng)計(jì)方法分析，人不典型增生白斑、鱗狀細(xì)胞癌中PCNA蛋白與p27蛋白、PTEN蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，PTEN蛋白的表達(dá)與p27蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。4.大鼠口腔正常粘膜、單純?cè)錾M織、異型增生組織至鱗狀細(xì)胞癌的病變過(guò)程中，PCNA蛋白表達(dá)量逐漸增加，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p27蛋白表達(dá)量逐漸降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；利用Spearman統(tǒng)計(jì)方法分析，在異常增生組織中PCNA蛋白表達(dá)與p27蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，在鱗狀細(xì)胞癌組織中PCNA蛋白表達(dá)與p27蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)�！窘Y(jié)論】1.從口腔單純?cè)錾装叩娇谇击[狀細(xì)胞癌的癌變過(guò)程中PCNA蛋白表達(dá)呈上升趨勢(shì)，而p27和PTEN蛋白表達(dá)則呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明在口腔癌前病變至口腔癌的發(fā)展過(guò)程中PCNA蛋白正調(diào)節(jié)功能亢進(jìn)，加速了細(xì)胞的增殖；而p27、PTEN蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)功能受抑制或缺失，不能有效抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。2.PCNA、p27蛋白在人口腔正常黏膜、不典型增生白斑及鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)與大鼠癌變模型中這兩個(gè)蛋白的表達(dá)情況相似，說(shuō)明人和動(dòng)物在致癌機(jī)理上有著相似之處，為今后藥物抑癌抗癌研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.PCNA、p27蛋白較為準(zhǔn)確的反應(yīng)口腔癌變過(guò)程中組織學(xué)上的變化，可考慮作為臨床檢測(cè)口腔癌前病變的“標(biāo)志分子”，為臨床上靶向分子治療提供依據(jù)。
前言
近年來(lái)我國(guó)口腔黏膜病科的就診疾病譜發(fā)生了明顯的改變，口腔癌前病變及癌前狀態(tài)所占病例相比以往有了較大幅度增加。根據(jù) WHO 定義，口腔癌前病變是指一種已有形態(tài)學(xué)上改變的組織，它較其外觀相對(duì)正常的組織具有更大的發(fā)癌可能，癌前病變疾病包括口腔白斑、紅斑等；而癌前狀態(tài)是指一種顯著增加發(fā)癌危險(xiǎn)的一般狀態(tài)[1]，包括口腔扁平苔蘚、口腔黏膜下纖維性變、盤(pán)狀紅斑狼瘡、上皮過(guò)角化、先天性角化不良及梅毒、著色性干皮病。關(guān)于白斑的癌變率，相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道不等，最高者甚至達(dá)到 50%以上，但一般都認(rèn)為在 5%以上；臨床上的研究發(fā)現(xiàn)，10%～20%的上皮異型增生白斑會(huì)發(fā)展為口腔癌，20%～30%發(fā)展成上皮重度異型增生，而這些伴重度異型增生的白斑 43%會(huì)發(fā)展成口腔癌。而紅斑的癌變率則會(huì)更高，臨床上發(fā)現(xiàn)，80%的紅斑病例病理切片為侵潤(rùn)癌或原位癌。在口腔癌前狀態(tài)中糜爛型及萎縮型扁平苔蘚癌變率較高，有報(bào)道達(dá) 10%�？谇话┣皳p害具有較高的癌變率，國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn) 90%以上的口腔鱗狀細(xì)胞癌是由口腔癌前損害發(fā)展而來(lái)。因此，提高口腔癌前損害的診療水平具有重要意義，研究口腔白斑及口腔扁平苔蘚的發(fā)病機(jī)制也成為歐美國(guó)家口腔醫(yī)學(xué)界的重點(diǎn)之一。
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二、材料與方法
（一）實(shí)驗(yàn)材料
1.病例選擇
1.1 人實(shí)驗(yàn)標(biāo)本選擇
1.1.1 標(biāo)原來(lái)自 2010-2012 年廈門(mén)市口腔醫(yī)院粘膜科就診白斑及鱗癌患者，均為初診病人，無(wú)體系疾病及其他免疫性疾病，未擔(dān)當(dāng)過(guò)免疫和體系治療。選擇 15例單純?cè)錾装摺?0 例不典范增生白斑、20 例鱗狀細(xì)胞癌，別的選擇 10 例口腔正常粘膜作為比較組。上述取材均得到福建醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)答應(yīng)和研究工具同意。
1.1.2 標(biāo)本的采集：切取適當(dāng)大小的病變處粘膜組織塊，組織經(jīng) 10%福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片 5μm 厚，根據(jù)臨床表現(xiàn)結(jié)合 HE 染色，確診為口腔白斑及口腔鱗狀細(xì)胞癌，白斑診斷標(biāo)準(zhǔn)參照口腔黏膜病學(xué)第三版[13]，鱗狀細(xì)胞癌診斷標(biāo)準(zhǔn)參照口腔頜面外科第二版[1]；對(duì)標(biāo)本進(jìn)行分級(jí)診斷確定組織學(xué)類型，所有診斷均采用雙盲法，未作染色的組織用于免疫組化。
1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)標(biāo)本選擇
1.2.1 選擇 09 年大鼠癌變模子白臘包埋構(gòu)造，包羅 15 例大鼠口腔鱗狀細(xì)胞癌構(gòu)造，15 例大鼠口腔異型增生構(gòu)造，大鼠口腔正常黏膜構(gòu)造及單純?cè)錾衬じ?10例。
1.2.2 標(biāo)本收羅：通例白臘包埋一連切片 5μm 厚，HE 染色確診為口腔白斑單純、異型增生及口腔鱗狀細(xì)胞癌，憑據(jù) WHO 口腔癌前病變協(xié)作中央 12 項(xiàng)診斷尺度（1978）[14]對(duì)標(biāo)本舉行分級(jí)診斷確定構(gòu)造學(xué)范例，全部診斷均接納雙盲法。未作染色的構(gòu)造用于免疫組化。
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（二）實(shí)驗(yàn)方法
2.1 組織病理學(xué)診斷-HE 染色
白臘構(gòu)造塊一連切 5μm 厚度，攤片至載玻片→將構(gòu)造切片放入 55℃烤箱烘烤40 分鐘（時(shí)間憑據(jù)切片的干燥水平?jīng)Q定）→將烤干后的切片浸入二甲苯第一缸、第二缸中各脫蠟 15 分鐘→浸入無(wú)水酒精第一缸、第二缸各 5 分鐘→95%酒精第一缸、第二缸各 5 分鐘→80%酒精 5 分鐘脫水→將切片從 80%酒精取出后放入蒸餾水中水化→切片浸入蘇木素染色液中染色 10 分鐘→0.5%鹽酸酒精分解 10-20秒→稀氨水（1%）返藍(lán)數(shù)秒→自來(lái)水沖洗一小時(shí)后放入蒸餾水半晌→入 70%和90%酒精中脫水各 10 分鐘→切片浸入 0.5%伊紅染色 2 分鐘→切片浸入 85%酒精5 分鐘→95%酒精第一、第二缸各 5 分鐘→100%酒精第一、第二缸各 5 分鐘→二甲苯第一、第二缸各 15 分鐘→在干燥情況中，中性樹(shù)膠封片。
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三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ....................16-44
（一）人實(shí)驗(yàn)結(jié)果 .....................16-34
（二）大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ....................34-44
討論
（一）口腔黏膜中 PCNA、p27、PTEN 表達(dá)意義
1、 口腔黏膜癌變過(guò)程中 PCNA、p27 及 PTEN 蛋白表達(dá)特點(diǎn)及其意義：
PCNA 卵白是 DNA 多聚酶 δ 幫助卵白，與 DNA 復(fù)制和細(xì)胞增殖親昵相干[15]，其通過(guò)調(diào)治 DNA 聚合酶的活性，在合成 DNA 時(shí)促使 DNA 鏈延伸，對(duì) DNA 的合成有催化作用。PCNA 卵白遍及存在于多種泉源的種種增生細(xì)胞中，一樣通常在增殖細(xì)胞中表達(dá)，而在靜止細(xì)胞中缺乏[16]，不停以來(lái)是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的可靠標(biāo)記物。PCNA 卵白量的變革反應(yīng)了細(xì)胞的增殖狀態(tài)變革，在正常環(huán)境下，機(jī)體細(xì)胞增殖和凋亡連結(jié)肯定的均衡，PCNA 卵白的表達(dá)量也相對(duì)恒定。然而，當(dāng)機(jī)體受到外界物理、化學(xué)或其他因素的連續(xù)刺激，PCNA 基因產(chǎn)生缺失或突變，或生長(zhǎng)因子非常表達(dá)導(dǎo)致 PCNA 基因轉(zhuǎn)化，PCNA 的 mRNA 程度非常增高，PCNA卵白就會(huì)出現(xiàn)相較于正常構(gòu)造細(xì)胞中不可比例的增高。而本實(shí)行效果恰恰驗(yàn)證這一點(diǎn)，本文研究效果表現(xiàn)：PCNA 卵白在生齒腔正常粘膜及單純?cè)錾装咧芯磉_(dá)陽(yáng)性；上皮細(xì)胞陽(yáng)性率均勻?yàn)?37.9%，在口腔不典范增生白斑中 PCNA 卵白表達(dá)量增長(zhǎng)，異型細(xì)胞的陽(yáng)性率均勻達(dá) 61.9%；而在鱗狀細(xì)胞癌中 PCNA 卵白的表達(dá)增長(zhǎng)更明顯，癌細(xì)胞陽(yáng)性率均勻達(dá) 80.5%，PCNA 卵白在鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中遍及表達(dá)。PCNA 卵白的表達(dá)在正常口腔黏膜、口腔單純白斑，不典范增生白斑，鱗狀細(xì)胞癌中隨病變程度加重，陽(yáng)性表達(dá)呈遞增趨向，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，這一效果評(píng)釋：隨著病變加重，細(xì)胞增殖活潑，PCNA 卵白表達(dá)上調(diào)明顯，而且很多研究證明，PCNA 卵白的表達(dá)能反應(yīng)腫瘤的惡性程度。
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結(jié)論
本文采用了免疫組化二步法檢測(cè)了 10 例正�？谇火つぁ�15 例單純?cè)錾装摺?0 例不典型增生白斑、20 例口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中 PCNA、p27 蛋白、PTEN 蛋白的表達(dá)，并檢測(cè)大鼠癌變模型中 10 例正�？谇火つぁ�10 例單純?cè)錾衬ぁ?5例不典型增生粘膜、15 例口腔鱗狀細(xì)胞癌中 PCNA 蛋白、p27 蛋白的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：
1.從口腔癌前病變到口腔鱗狀細(xì)胞癌組織，PCNA 蛋白的表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)單純?cè)錾装�、口腔白斑不典型增生、口腔鱗癌中蛋白表達(dá)量增加差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明在口腔粘膜癌變過(guò)程中 PCNA 蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的正調(diào)節(jié)功能亢進(jìn)，從而加速了細(xì)胞增殖，最后導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)限增殖，腫瘤發(fā)生。而在口腔單純?cè)錾装�、口腔白斑不典型增生、口腔鱗癌組織中 p27、PTEN 蛋白表達(dá)則呈逐漸下降趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析三者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明在口腔癌前病變至口腔癌的發(fā)生過(guò)程中 p27 蛋白、PTEN 蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)功能受到抑制或失去代償，不能有效的抑制細(xì)胞的增殖，因而促使了癌前病變向癌的轉(zhuǎn)變和發(fā)展。
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本文編號(hào)：9172
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