本文關(guān)鍵詞：下一代測序技術(shù)在混合DNA分析中的應(yīng)用研究　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:盡管這些年對于混合DNA的分型研究取得了一些進(jìn)展,但仍有諸多問題未得到有效解決,混合DNA分型依然是當(dāng)前法醫(yī)遺傳學(xué)研究的難點。鑒于傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳STR分型技術(shù)的局限性,不能充分挖掘混合DNA中蘊(yùn)藏的遺傳信息。近幾年來,下一代測序技術(shù)(next generation sequencing,NGS)引起了法醫(yī)學(xué)者的極大興趣同時法醫(yī)學(xué)者也正致力于將其向法醫(yī)遺傳領(lǐng)域應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。下一代測序STR分型技術(shù)較毛細(xì)管電泳具有極大的優(yōu)勢,它既能觀察各STR基因座的長度多態(tài)性信息,又能檢測到各基因座序列多態(tài)性信息,從中發(fā)掘出更多信息,這為混合DNA解釋提供了一個新的研究方向。因此,本研究擬采用Precision ID Global Filer NGS STR Panel在Ion Torrent PGM?平臺進(jìn)行測序分析,分為系列實驗對其重復(fù)性、一致性、靈敏度進(jìn)行實驗室內(nèi)部評價,在此基礎(chǔ)上,利用NGS平臺對構(gòu)建的兩男混合DNA樣本進(jìn)行測序分析,對混合DNA主要參數(shù)進(jìn)行評估并采用本實驗室自主研發(fā)的sep DNA軟件進(jìn)行分析,旨在為混合DNA解釋提供參考。方法:1樣本采集:取自河北省血液中心50份無關(guān)健康男性個體抗凝血樣。3個標(biāo)準(zhǔn)品分別為9948 male DNA、2800 Control DNA和DNA Control 007。2 DNA提取:應(yīng)用Relia Prep?Blood g DNA Miniprep System試劑盒提取血樣DNA,采用Nano Q?微型分光光度計進(jìn)行全基因組DNA純度檢測。3 DNA定量:應(yīng)用Quantifiler?Human DNA Quantification Kit定量試劑盒對提取的全基因組DNA以及3個標(biāo)準(zhǔn)品采用7500 Real-time PCR System進(jìn)行絕對定量。4樣本準(zhǔn)備4.1實驗室評價部分:以9948 Male DNA標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建文庫進(jìn)行測序,平行實驗3次進(jìn)行重復(fù)性研究;以取自河北省血液中心17份無關(guān)健康男性個體抗凝血樣和3個標(biāo)準(zhǔn)品測序進(jìn)行一致性研究;以9948 Male DNA標(biāo)準(zhǔn)品絕對定量結(jié)果制備系列起始DNA模板量(1 ng、500 pg、200 pg、100 pg、50 pg)進(jìn)行測序,每個樣本平行實驗2次進(jìn)行靈敏度研究。4.2混合DNA部分:根據(jù)定量結(jié)果以DNA濃度非常接近為歸類標(biāo)準(zhǔn),將50個男性樣本的DNA定量結(jié)果進(jìn)行歸類分組,選出其中符合標(biāo)準(zhǔn)的單一DNA樣本構(gòu)建4組兩男混合DNA樣本,每組混合樣本設(shè)定4個混合比率(1:1、1:4、1:9和1:19)。每個混合樣本平行實驗兩次。5文庫構(gòu)建:應(yīng)用Precision ID Global Filer?NGS STR Panel和Precision ID Library Kit按照說明構(gòu)建文庫。除外靈敏度研究中采用制備的起始DNA模板量外,其余樣本均稀釋至1 ng/μl,采用1 ng起始DNA模板量構(gòu)建文庫。6模板制備:采用Ion PGM?Hi?Q?OT2 Kit在Ion One Touch?2System儀器上按照說明制備測序模板。7 Ion PGM?測序:采用Ion PGM?Hi?Q?STR Sequencing Kit,在Ion PGM?System按照手冊說明進(jìn)行測序操作。8測序數(shù)據(jù)處理:測序結(jié)果采用Ion Torrent Suite?以及附帶的HID_STR_Genotyper和Coverage Analysis進(jìn)行分析。9 CE-STR分型:所有單一樣本同時采用Power Plex?Fusion System進(jìn)行檢測分型,用于與NGS-STR分型的比較。10結(jié)果分析:首先對分析閾值確定等位基因和過濾noise的效能進(jìn)行評價。通過對樣本Do C、基因座平均Do C、基因座序列構(gòu)成比以及ACR等參數(shù)的計算和統(tǒng)計分析對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行評價。在此基礎(chǔ)上對測序樣本的重復(fù)性、一致性和靈敏度進(jìn)行統(tǒng)計分析,綜合評價在本實驗室的效能。利用NGS平臺對構(gòu)建的兩男混合DNA樣本進(jìn)行測序分析,對混合DNA主要參數(shù)進(jìn)行評估并采用本實驗室自主研發(fā)的sep DNA軟件進(jìn)行分析。結(jié)果:1 Precision ID Global Filer?NGS STR Panel的實驗室評價:1.1分析閾值在默認(rèn)分析閾值(即AT=5%)能過濾掉絕大多數(shù)noise序列達(dá)到較好的效能。1.2數(shù)據(jù)質(zhì)量分析數(shù)據(jù)質(zhì)量參數(shù)經(jīng)統(tǒng)計顯示,樣本平均Do C為2535×;基因座平均Do C為2542×;在基因座序列構(gòu)成比中,基因座%allele平均為90.83%,%stutter平均為4.22%,%noise平均為5.21%;STR基因座ACR平均為0.76,有2個基因座(D12S391和D12ATA63)平均ACR0.6。1.3重復(fù)性研究3次重復(fù)間等位基因分型一致并且%Allele和ACR均無顯著性差異。1.4一致性研究在CE-STR與NGS-STR可比較的761個等位基因中有758(99.61%)個等位基因分型一致,兩者有3(0.39%)個等位基因在D18S51出現(xiàn)不一致性分型。同時在D2S441、D1S1656、D8S1179、D3S1358、v WA、D21S11、D2S1338和D12S391等8個基因座檢出同等位基因。1.5靈敏度研究在默認(rèn)分析閾值下,起始DNA模板量低至100 pg時等位基因仍可被完全檢出;起始DNA模板量為50 pg時等位基因發(fā)生較多的dropout,等位基因檢出率為88.68%。不同起始DNA模板量ACR顯示,起始DNA模板量低至100 pg,平均ACR為0.598,仍能得到較好的均衡性。隨著起始模板量的降低,平均ACR從0.729降至0.329,CV從23.95%增至98.21%。2 Precision ID Global Filer?NGS STR Panel對混合DNA分型的研究:混合DNA研究中8個單一樣本構(gòu)建4組混合樣本,每組混合樣本設(shè)置4個不同混合比率,總共含有16個混合樣本,每個混合樣本平行實驗2次。計算每個樣本平均等位基因檢出個數(shù)時按照四舍五入取整數(shù)的方式進(jìn)行等位基因計數(shù)。2.1等位基因的序列信息進(jìn)行同等位基因的區(qū)分NGS-STR可以檢測等位基因的序列差異進(jìn)行同等位基因的區(qū)分。例如,觀察到在混合比率1:9,v WA基因座次要組分(14,17)和主要組分(17,18)共享等位基因17。利用序列差異,次要組分等位基因17能夠從主要組分等位基因中得到區(qū)分;D1S1656基因座次要組分(11,14)的等位基因11與主要組分(12,15)等位基因12的n-1 stutter重疊,利用序列差異可以將兩者進(jìn)行區(qū)分。2.2各混合比率樣本基因座平均Do C在混合比率為1:1時,基因座平均Do C最低為451±130×(FGA),最高為7263±2105×(Amelogenin)。在混合比率為1:4時,基因座平均Do C最低為698±222×(FGA),最高為10636±3520×(TPOX)。在混合比率為1:9時,基因座平均Do C最低為565±223×(D3S4529),最高為9249±1640×(TPOX)。在混合比率為1:19時,基因座平均Do C最低為563±214×(D3S4529),最高為10571±2176×(TPOX)。2.3不同混合比率等位基因檢出情況在混合比率為1:1、1:4、1:9和1:19時,默認(rèn)分析閾值下每個混合比率總的等位基因檢出數(shù)目分別為365、354、309和281個,分別有0、0、7和15個等位基因丟失,等位基因檢出率分別為100%,96.98%、84.66%和76.99%。在混合比率為1:1、1:4、1:9和1:19時,每個混合比率的次要組分未共享等位基因分別共檢出134、134、130和121個,在默認(rèn)分析閾值下分別共檢出134、124、78和49個,檢出率分別為100%、92.54%、60.00%和40.50%。2.4混合DNA主要參數(shù)評估2.4.1混合DNA雜合型均衡比(H_b)混合樣本主要組分平均H_b在每個混合比率展現(xiàn)了較好的均衡性,在4個混合比率中平均H_b最小值為0.70,最大值為0.78。在混合比率為1:1和1:4時,次要組分平均H_b分別為0.73和0.67,均呈現(xiàn)出較好的均衡性;在混合比率為1:9和1:19時,H_b呈現(xiàn)較大變異甚至發(fā)生雜合性丟失,平均H_b分別為0.54和0.45。2.4.2 D值和實測混合比例(Mx1)分析Mx分析中基因座D值分布顯示所有基因座絕大部分?jǐn)?shù)據(jù)位于D值0.2且基因座Do C4000×的區(qū)間內(nèi),其中82%的基因座D值0.1,93%的基因座D值0.15。除1:1外,其余混合比率絕對部分D值均0.1�；旌媳嚷蕿�1:1時,4個樣本Mx1最小值為0.47,最大值為0.49;混合比率為1:4時,4個樣本Mx1最小值為0.16,最大值為0.19;混合比率為1:9時,4個樣本Mx1最小值為0.08,最大值為0.12;混合比率為1:19時,4個樣本Mx1最小值為0.05,最大值為0.07�；旌媳嚷蕪�1:1降低至1:19時,變異系數(shù)從27.21%增至54.19%。2.5 sep DNA軟件分析—分離準(zhǔn)確率2.5.1整體分離準(zhǔn)確率在最優(yōu)基因型,Bayes和Iter數(shù)學(xué)模型的分離準(zhǔn)確率分別為64.91%;和64.28%;兩者分離準(zhǔn)確率沒有顯著性差異(P=0.7734)。在考慮備選基因型后,Bayes和Iter數(shù)學(xué)模型的分離準(zhǔn)確率分別為74.18%和71.13%,兩者分離準(zhǔn)確率沒有顯著性差異(P=0.1353)。2.5.2不同混合比率分離準(zhǔn)確率在最優(yōu)基因分型時,Bayes數(shù)學(xué)模型在1:1、1:4、1:9和1:19的分離準(zhǔn)確率分別為52.15%、75.76%、72.40%和65.05%;Iter數(shù)學(xué)模型在在1:1、1:4、1:9和1:19的分離準(zhǔn)確率分別為50.14%、75.36%、72.39%和65.07%。在考慮備選基因型分型后,Bayes數(shù)學(xué)模型在1:1、1:4、1:9和1:19的分離準(zhǔn)確率分別為65.17%、84.87%、81.73%和73.20%;Iter數(shù)學(xué)模型在在1:1、1:4、1:9和1:19的分離準(zhǔn)確率分別為58.82%、83.74%、79.10%和68.08%。2.5.3等位基因共享對分離準(zhǔn)確率的影響B(tài)ayes數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析,在最優(yōu)基因型時,有共享基因座的分離準(zhǔn)確率為60.00%,未共享基因座的分離準(zhǔn)確率為71.83%,兩者存在顯著性差異(P=0.0002);在考慮備選基因型后,有共享基因座的分離準(zhǔn)確率為70.81%,未共享基因座的分離準(zhǔn)確率為78.93%,兩者存在顯著性差異(P=0.0048),提示在兩種情形下未共享基因座的分離準(zhǔn)確率均顯著高于共享基因座。Iter數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析,在最優(yōu)基因型時,有共享基因座的分離準(zhǔn)確率為59.64%,未共享基因座的分離準(zhǔn)確率為70.81%,兩者存在顯著性差異(P=0.0004);在考慮備選基因型分型后,有共享基因座的分離準(zhǔn)確率為66.67%,未共享基因座的分離準(zhǔn)確率為77.41%,兩者存在顯著性差異(P=0.0003),提示在兩種情形下未共享基因座的分離準(zhǔn)確率顯著高于共享基因座。結(jié)論:1 Precision ID Global Filer NGS STR Panel結(jié)合Ion Torrent PGM?平臺在本實驗室展現(xiàn)了良好的表現(xiàn)可以成功地應(yīng)用于STR分析。2應(yīng)用NGS技術(shù)進(jìn)行混合DNA的STR分型,較CE-STR分型技術(shù)可獲得更多有價值的信息如同等位基因,甚至混合比率低至1:19時次要組分部分等位基因仍可檢出。應(yīng)用本實驗室研發(fā)的sep DNA軟件對NGS-STR混合DNA分型結(jié)果進(jìn)行分析,結(jié)果表明以等位基因reads數(shù)目作為定量信息進(jìn)行混合DNA分析是可行的。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：D919.4

【參考文獻(xiàn)】

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1 王樂;葉健;白雪;楊帆;趙興春;;二代測序技術(shù)及其在法醫(yī)遺傳學(xué)中的應(yīng)用[J];刑事技術(shù);2015年05期

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本文編號：1327380