發(fā)布時間：2017-10-03 21:16

  本文關(guān)鍵詞：大麥草酸氧化酶與WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控核盤菌抗性的分子機(jī)理

  更多相關(guān)文章： 甘藍(lán)型油菜 核盤菌 大麥草酸氧化酶 WRKY33 WRKY15

【摘要】：菌核病是我國油的主要油菜病害之一,對我國油菜生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響;對于油菜對菌核病的反應(yīng)機(jī)制的研究有助于我們了解油菜-菌核病互作,對于我們油菜抗病育種具有重要意義。研究工作主要分兩個方面進(jìn)行的:1.核盤菌在侵染植物時會分泌草酸以幫助其入侵植物組織,而草酸氧化酶可以分解草酸為二氧化碳和過氧化氫,我們通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法將大麥草酸氧化酶(Y14203)轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜,提高了對菌核病的抗性。在接種核盤菌72h后,與對照相比,轉(zhuǎn)基因植株的病斑面積減少15-61%,表現(xiàn)出對核盤菌顯著的葉片抗性。而且,轉(zhuǎn)基因植株接種核盤菌后的草酸鹽水平下降,同時伴隨過氧化氫水平的上升。另外,涉及到過氧化氫信號路徑的基因表達(dá)水平在轉(zhuǎn)基因植株中表現(xiàn)出上升的趨勢。因此,我們將轉(zhuǎn)化大麥草酸氧化酶基因提升抗性的原因歸結(jié)為增強(qiáng)植株對草酸鹽的代謝升高的過氧化氫水平以及過氧化氫信號路徑上的基因表達(dá)水平的上升。2.基于本實(shí)驗(yàn)室之前抑制性差減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)的結(jié)果,檢測并分離到一個受到核盤菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因Bn WRKY33;基于內(nèi)含子多態(tài)性標(biāo)記,將其定位于A5連鎖群上;在Westar材料中過表達(dá)Bn WRKY33可以提高核盤菌抗性,而且在轉(zhuǎn)基因植株中合成camalexin的基因表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá);對其啟動子分析發(fā)現(xiàn)其受到水楊酸及核盤菌的誘導(dǎo),對啟動子進(jìn)行截短實(shí)驗(yàn)獲得含有3個W-box的受到核盤菌誘導(dǎo)的區(qū)段,利用這個區(qū)段進(jìn)行酵母單雜交篩選Bn WRKY33上游調(diào)控其轉(zhuǎn)錄水平的轉(zhuǎn)錄因子,結(jié)果篩選到一個與At WRKY15同源的WRKY轉(zhuǎn)錄因子Bn WRKY15;利用EMSA和擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達(dá)驗(yàn)證了這種互作的真實(shí)性,同時也檢測到Bn WRKY33與這段區(qū)域的結(jié)合;轉(zhuǎn)錄激活檢測發(fā)現(xiàn)Bn WRKY15是一個弱的轉(zhuǎn)錄激活子,而Bn WRKY33是一個典型的轉(zhuǎn)錄激活子,轉(zhuǎn)錄激活/抑制結(jié)構(gòu)域作圖發(fā)現(xiàn)Bn WRKY33存在兩個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,而Bn WRKY15存在一個轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域;Bn WRKY15在擬南芥原生質(zhì)體中會降低Bn WRKY33對自身的轉(zhuǎn)錄激活,同時在Bn WRKY15過表達(dá)植株中Bn WRKY33及其調(diào)控合成camalexin相關(guān)的基因都表現(xiàn)出表達(dá)量下降的情況,并且過表達(dá)植株的菌核病抗性初步鑒定也表現(xiàn)出抗性下降;利用轉(zhuǎn)錄激活和EMSA競爭性試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Bn WRKY15對Bn WRKY33對自身激活能力的影響機(jī)制可以歸結(jié)為兩個方面:1.Bn WRKY15抑制Bn WRKY33的轉(zhuǎn)錄激活能力;2.Bn WRKY15與Bn WRKY33一起競爭WRKY33啟動子上的W-box,而且Bn WRKY15具有更強(qiáng)的W-box結(jié)合能力。另外,也檢測到受核盤菌誘導(dǎo)表達(dá)的Bn WRKY28和Bn WRKY40也可以結(jié)合到Bn WRKY33的啟動子上,說明Bn WRKY33在植物環(huán)境的刺激反應(yīng)中可能處于調(diào)控的中心。
【關(guān)鍵詞】：甘藍(lán)型油菜 核盤菌 大麥草酸氧化酶 WRKY33 WRKY15
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S432.4
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 縮略語表12-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-30
• 1 病菌的生物學(xué)特性13-17
• 1.1 菌核病的基本介紹13
• 1.2 核盤菌的生物學(xué)特性13-15
• 1.3 核盤菌致病機(jī)理15-16
• 1.3.1 核盤菌對植物的入侵過程15
• 1.3.2 草酸在核盤菌浸染中的重要性15-16
• 1.4 油菜菌核病抗性分子機(jī)制研究進(jìn)展16-17
• 1.4.1 轉(zhuǎn)錄水平研究植物對核盤菌的反應(yīng)16-17
• 1.4.2 蛋白組水平研究植物對核盤菌的反應(yīng)17
• 2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子17-30
• 2.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與分類18-20
• 2.2 W-box20-23
• 2.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子互作蛋白23-27
• 2.3.1 WRKY-WRKY之間的互作23
• 2.3.2 WRKY蛋白與VQ蛋白之間的互作23-25
• 2.3.3 WRKY轉(zhuǎn)錄因子與MAPK之間的互作25-26
• 2.3.4 與WRKY蛋白互作的其他蛋白26-27
• 2.4 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能27-30
• 2.4.1 WRKY蛋白參與植物防衛(wèi)反應(yīng)信號的傳遞28
• 2.4.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育過程中的作用28-30
• 第二章 轉(zhuǎn)化大麥草酸氧化酶提高甘藍(lán)型油菜菌核病抗性及其抗性機(jī)理初析30-55
• 1 材料與方法30-40
• 1.1 試驗(yàn)材料30-31
• 1.2 大麥草酸氧化酶基因片段的獲得及植物轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建31-34
• 1.3 植物轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌34
• 1.4 甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因植株的獲得34-35
• 1.5 草酸氧化酶酶活測定35-36
• 1.6 轉(zhuǎn)基因植株菌核病抗性鑒定36
• 1.7 對油菜葉片用過氧化氫及脫落酸（abscisic acid, ABA）進(jìn)行處理36
• 1.8 檢測轉(zhuǎn)基因植株的過氧化氫水平與草酸鹽水平36-37
• 1.9 DNA提取及基于PCR水平對轉(zhuǎn)基因單株的鑒定37-38
• 1.10 RNA分離及定量PCR38-40
• 2 結(jié)果與分析40-52
• 2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的獲得40-41
• 2.2 轉(zhuǎn)基因油菜植株的獲得及抗性鑒定41
• 2.3 轉(zhuǎn)基因植株菌核病抗性鑒定41-44
• 2.4 轉(zhuǎn)基因植株的草酸氧化酶酶活測定以及接種核盤菌后草酸鹽含量測定44-45
• 2.5 草酸氧化酶酶活的升高是與過氧化氫水平的升高是相關(guān)的45-47
• 2.6 過氧化氫途徑相關(guān)的基因在轉(zhuǎn)基因材料中被激活47-50
• 2.7 轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對外施ABA的敏感性50-52
• 3 討論52-55
• 3.1 轉(zhuǎn)BOXO基因可以高甘藍(lán)型油菜對核盤菌的抗性52
• 3.2 H_2O_2及其途徑上相關(guān)基因?qū)剐缘呢暙I(xiàn)52-54
• 3.3 ABA與菌核病抗性的關(guān)系54-55
• 第三章 WRKY15可以調(diào)控WRKY33對菌核病的抗性55-105
• 1 材料與方法55-69
• 1.1 試驗(yàn)材料55
• 1.2 油菜水的楊酸處理及核盤菌接種55-56
• 1.3 RNA提取及q PCR56
• 1.4 載體構(gòu)建56-61
• 1.4.1 過表達(dá)載體構(gòu)建56-57
• 1.4.2 RNAi載體構(gòu)建57
• 1.4.3 啟動子分離及啟動子載體構(gòu)建57-59
• 1.4.4 亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建59-60
• 1.4.5 原核表達(dá)載體構(gòu)建60
• 1.4.6 Bradford法蛋白定量60
• 1.4.7 原生質(zhì)體瞬時表達(dá)載體構(gòu)建60-61
• 1.4.8 酵母單雜載體構(gòu)建61
• 1.5 油菜的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及PCR鑒定61-62
• 1.6 擬南芥的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化62
• 1.7 轉(zhuǎn)基因材料的PCR檢測62
• 1.8 擬南芥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化62-63
• 1.9 亞細(xì)胞定位63-64
• 1.10 GUS染色64-65
• 1.11 酵母文庫的構(gòu)建及篩庫65-68
• 1.12 原核表達(dá)68
• 1.13 凝膠阻滯電泳68
• 1.14 原生質(zhì)體的瞬時表達(dá)68-69
• 2 結(jié)果與分析69-98
• 2.1 Bn WRKY33在染色體上的定位及序列分析69-71
• 2.2 Bn WRKY33受到水楊酸和核盤菌的誘導(dǎo)表達(dá)71-72
• 2.3 Bn WRKY33基因的亞細(xì)胞定位72-73
• 2.4 Bn WRKY33參與甘藍(lán)型油菜對菌核病的抗性73-75
• 2.5 Bn WRKY33過表達(dá)提高camalexin合成途徑基因的表達(dá)75
• 2.6 Bn WRKY33啟動子表達(dá)模式分析75-76
• 2.7 Bn WRKY33啟動子截短分析76-77
• 2.8 酵母文庫的構(gòu)建及篩選77-81
• 2.9 凝膠阻滯電泳體外驗(yàn)證Bn WRKY15、Bn WRKY33與W-box的結(jié)合81-83
• 2.10 原生質(zhì)體瞬時表達(dá)檢測Bn WRKY15、Bn WRKY33與W-box的結(jié)合83-85
• 2.11 Bn WRKY15的生物信息學(xué)分析85-86
• 2.12 Bn WRKY15的表達(dá)模式86-88
• 2.13 Bn WRKY15的亞細(xì)胞定位88-89
• 2.14 Bn WRKY15與Bn WRKY33的轉(zhuǎn)錄激活活性89-91
• 2.15 Bn WRKY15和Bn WRKY33的轉(zhuǎn)錄激活或抑制結(jié)構(gòu)域的作圖91-93
• 2.16 Bn WRKY15對Bn WRKY33轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響機(jī)制93-95
• 2.17 其他WRKY類轉(zhuǎn)錄因子對WRKY33的調(diào)控95-97
• 2.18 Bn WRKY15過表達(dá)甘藍(lán)型油菜表型鑒定97-98
• 3 討論98-105
• 3.1 Bn WRKY33參與油菜對核盤菌的抗性98-99
• 3.2 Bn WRKY33啟動子上其他兩個W-box的作用99-100
• 3.3 Bn WRKY33參與對自身的信號放大效應(yīng)100-101
• 3.4 Bn WRKY15對Bn WRKY33的調(diào)控機(jī)制101-102
• 3.5 Bn WRKY15對于Bn WRKY33的調(diào)控作用102-103
• 3.6 Bn WRKY33在植物對環(huán)境刺激的反應(yīng)中起著調(diào)控中心的作用103-105
• 參考文獻(xiàn)105-117
• 致謝117-119
• 附錄1 甘藍(lán)型油菜農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用的培養(yǎng)基與試劑配方119-120
• 附錄2 Hoagland營養(yǎng)液配方120-121
• 作者簡介及在讀期間發(fā)表論文121

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 李蕾,謝丙炎,戴小楓,楊宇紅;WRKY轉(zhuǎn)錄因子及其在植物防御反應(yīng)中的作用[J];分子植物育種;2005年03期

2 田云;盧向陽;彭麗莎;方俊;;植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其生物學(xué)功能[J];遺傳;2006年12期

3 王麗;王曉麗;劉佳;衣志剛;董志敏;;植物草酸氧化酶及其基因的研究進(jìn)展[J];中國農(nóng)學(xué)通報(bào);2010年07期

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張偉杰;甘藍(lán)型油菜抗應(yīng)答盤菌侵染早期表達(dá)模式分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

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本文編號：966774