發(fā)布時間：2017-10-03 12:03

  本文關(guān)鍵詞：分子修飾狂犬病ERA疫苗株及表達埃博拉或馬爾堡病毒GP重組ERA疫苗株的研究

  更多相關(guān)文章： 狂犬病病毒 口服疫苗 埃博拉病毒 馬爾堡病毒 重組病毒 GP 免疫原性

【摘要】：Ⅰ:分子修飾狂犬病毒ERA疫苗株的研究狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的一種人獸共患病,一旦出現(xiàn)神經(jīng)癥狀致死率幾乎達100%。全世界每年約60,000人死于該病,超過95%發(fā)生在非洲和亞洲。幾乎所有的人間狂犬病死亡病例均由犬咬傷或抓傷所傳播,而疫苗接種能有效防控狂犬病的肆虐。日益增多的流浪犬、散養(yǎng)家畜和野生動物狂犬病的存在加大了狂犬病流行區(qū)人感染狂犬病的風(fēng)險,針對這些動物進行口服免疫比傳統(tǒng)的注射免疫更具有可行性。因此,安全、有效的狂犬病口服疫苗的研發(fā)仍具有重要意義。本研究對G333位點突變成谷氨酸(E)的分子修飾狂犬病病毒ERA疫苗株(r ERAG333E)進行生物學(xué)特性分析,并對其作為犬狂犬病口服疫苗的潛力進行了評價。r ERAG333E在BSR細胞上的生長動力學(xué)曲線與親本疫苗株ERA相似,在感染后96 h達到最高滴度(108.24 FFU/m L),與ERA的最高滴度(108.26 FFU/m L)基本一致。r ERAG333E分別在乳鼠腦內(nèi)連續(xù)傳5代和NA細胞上連續(xù)傳20代,其G333E突變不發(fā)生回復(fù)突變,具有遺傳穩(wěn)定性。r ERAG333E的體外嗜神經(jīng)指數(shù)(neurotropism index,NI)為0,不具有體外嗜神經(jīng)性,而ERA的NI為0.4。將r ERAG333E和ERA分別按1×106和1×105 FFU/30μL/只的劑量顱內(nèi)接種感染成年BALB/c小鼠和乳鼠,r ERAG333E感染組成年小鼠未見任何明顯的狂犬病癥狀,而r ERA感染組成年小鼠14日內(nèi)全部死亡,表明G333E突變失去了ERA疫苗株對成年小鼠的致病力;r ERAG333E和r ERA均能致死乳鼠,但r ERAG333E感染組乳鼠的死亡進程較r ERA感染組推后了2天,表明G333E突變降低了ERA株對乳鼠的致病力。將r ERAG333E經(jīng)肌肉途徑接種BALB/c小鼠和比格犬,可誘導(dǎo)顯著的RABV中和抗體反應(yīng),并對小鼠提供完全的攻毒保護,表明r ERAG333E株對小鼠和犬均具有良好的免疫原性。為進一步評估r ERAG333E的口服免疫效力,將r ERAG333E分別按106、107、108 FFU/100μL/只的劑量經(jīng)口服途徑接種小鼠,均可誘導(dǎo)顯著、持續(xù)1年以上的RABV中和抗體反應(yīng),免疫后1年各免疫組小鼠均能獲得完全攻毒保護。同時,將r ERAG333E分別按108、109 FFU/1,000μL/只的劑量經(jīng)口服途徑1次接種或間隔55周2次接種比格犬。結(jié)果顯示,1次接種組口服接種犬能誘導(dǎo)顯著的RABV中和抗體反應(yīng),免疫后156周109 FFU和108 FFU劑量組犬血清RABV中和抗體滴度平均值分別為1.24 IU/m L和0.34 IU/m L(2/40.5 IU/m L);2次接種組初次免疫后55周,109和108 FFU劑量組犬血清RABV中和抗體滴度平均值分別為1.54 IU/m L和2.71 IU/m L,加強免疫后能誘導(dǎo)顯著的免疫記憶效應(yīng),加強免疫后104周109和108FFU劑量組犬血清RABV中和抗體滴度平均值分別為1.80 IU/m L和1.61 IU/m L;此外,r ERAG333E口服免疫后4周109和108FFU劑量組犬唾液RABV特異性Ig A轉(zhuǎn)陽率分別為50%(5/10)和60%(6/10)。上述所有免疫犬均未出現(xiàn)任何狂犬病相關(guān)癥狀。本研究結(jié)果表明,分子修飾的ERA株r ERAG333E對犬具有良好的安全性,能誘導(dǎo)犬產(chǎn)生持續(xù)三年以上的中和抗體反應(yīng),以及特異性黏膜Ig A反應(yīng),具有作為犬狂犬病口服疫苗的潛力。Ⅱ:表達埃博拉或馬爾堡病毒GP重組ERA疫苗株的研究埃博拉出血熱(Ebola hemorrhagic fever,EHF)和馬爾堡出血熱(Marburg hemorrhagic fever,MHF)分別由埃博拉病毒(Ebola virus,EBOV)和馬爾堡病毒(Marburg virus,MBGV)引起,均為烈性人畜共患病,以發(fā)熱、急性出血、高發(fā)病率和高死亡率為特征。EHF和MHF均能在人間傳播,并能感染蝙蝠等多種野生動物和犬、豬等強流動性家畜,該類病一旦發(fā)生將造成嚴重的公共安全問題。到目前為止仍無官方許可的人用EHF和MHF疫苗投入使用,并且通過注射途徑免疫野生動物和流動性強的家養(yǎng)動物以清除傳染源和切斷傳播途徑顯得極其困難。因此,研制有效的EHF或MHF人用滅活疫苗和動物口服疫苗顯得尤為緊迫和重要。本研究以狂犬病候選口服疫苗株r ERAG333E為活病毒載體,分別構(gòu)建了表達扎伊爾EBOV(ZEBOV)、蘇丹EBOV(SEBOV)或MBGV的野生型GP(wt-G)或密碼子優(yōu)化GP(co-G)的重組病毒r ERAG333E/ZGP、r ERAG333E/ZGPGCD、r ERAG333E/SGP、r ERAG333E/SGPGCD、r ERAG333E/MGP和r ERAG333E/MGPGCD。這些重組RABVs能夠正確地表達外源蛋白,并具有與載體病毒r ERAG333E相似的BSR細胞生長適應(yīng)性和穩(wěn)定性。分別通過將埃博拉相關(guān)重組病毒顱內(nèi)感染成年小鼠和乳鼠及馬爾堡相關(guān)重組病毒口服和肌肉感染成年小鼠,感染后的成年小鼠均未見任何明顯的狂犬病癥狀,而感染后乳鼠的死亡進程與載體組相似,結(jié)果表明EBOV或MBGV GP基因的插入和表達沒有增強載體病毒對小鼠的致病力。為評估埃博拉相關(guān)重組RABVs對小鼠的免疫原性,將重組病毒r ERAG333E/ZGP、r ERAG333E/ZGPGCD、r ERAG333E/SGP、r ERAG333E/SGPGCD和親本株r ERAG333E在小鼠模型上分別口服或肌肉1次接種活病毒或間隔3周2次肌肉接種滅活的病毒培養(yǎng)物。結(jié)果顯示,埃博拉相關(guān)重組RABVs按以上三種不同的途徑/劑型免疫接種小鼠,均能誘導(dǎo)持續(xù)13周的高水平RABV中和抗體(RABV VNA)和抗ZEBOV或SEBOV GP假病毒中和抗體(ZEBOV或SEBOV VNA)反應(yīng)。此外,重組RABVs分別經(jīng)以上三種途徑/劑型免疫接種小鼠均能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗ZEBOV或SEBOV GP的Ig G和Ig G2a反應(yīng);與活病毒和滅活病毒肌肉接種組相比,口服接種組小鼠血清中的Ig G水平略低,但Ig G2a維持在相似的水平。分別表達EBOV wt-G或co-G的重組RABVs經(jīng)以上三種不同的途徑/劑型接種小鼠,誘導(dǎo)的RABV、ZEBOV或SEBOV VNA反應(yīng)及相應(yīng)的Ig G及Ig G2a水平無顯著差異。結(jié)果表明,重組病毒r ERAG333E/ZGP、r ERAG333E/ZGPGCD、r ERAG333E/SGP和r ERAG333E/SGPGCD經(jīng)口服接種活病毒或肌肉接種滅活病毒均具有良好的免疫原性。為評估馬爾堡相關(guān)重組RABVs對小鼠的免疫原性,將重組病毒r ERAG333E/MGP、r ERAG333E/MGPGCD和親本株r ERAG333E在小鼠模型上分別口服或肌肉1次接種活病毒或間隔3周2次肌肉接種滅活的病毒培養(yǎng)物。結(jié)果顯示,r ERAG333E/MGP和r ERAG333E/MGPGCD按三種不同的途徑/劑型免疫接種小鼠,均能誘導(dǎo)高水平的RABV VNA反應(yīng)和抗MBGV假病毒中和抗體反應(yīng)(MBGV VNA);初次免疫后5周能完全保護所有免疫小鼠抵抗致死量RABV街毒株GX/09的攻擊;分別表達MBGV wt-G或co-G的重組RABVs經(jīng)以上三種不同的途徑/劑型免疫小鼠,誘導(dǎo)的RABV和MBGV VNA水平無顯著差異。結(jié)果表明,重組病毒r ERAG333E/MGP和r ERAG333E/MGPGCD經(jīng)口服接種活病毒或肌肉接種滅活病毒均具有良好的免疫原性。本研究結(jié)果表明,重組病毒r ERAG333E/ZGP、r ERAG333E/ZGPGCD、r ERAG333E/SGP、r ERAG333E/SGPGCD、r ERAG333E/MGP和r ERAG333E/MGPGCD在小鼠模型上均具有良好的安全性和免疫原性,分別有希望作為防控扎伊爾、蘇丹埃博拉出血熱或馬爾堡出血熱與狂犬病的二聯(lián)動物口服疫苗和人用滅活疫苗。
【關(guān)鍵詞】：狂犬病病毒 口服疫苗 埃博拉病毒 馬爾堡病毒 重組病毒 GP 免疫原性
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S855.3
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-17
• 英文縮略表17-18
• 第一章 緒論18-34
• 1.1 引言18
• 1.2 狂犬病病毒18-23
• 1.2.1 分類18-19
• 1.2.2 形態(tài)結(jié)構(gòu)19-20
• 1.2.3 蛋白結(jié)構(gòu)與功能20-23
• 1.2.3.1 核蛋白20
• 1.2.3.2 磷蛋白20-21
• 1.2.3.3 基質(zhì)蛋白21
• 1.2.3.4 糖蛋白21-22
• 1.2.3.5 依賴RNA的RNA聚合酶蛋白22-23
• 1.3 狂犬病流行病學(xué)概況23-24
• 1.3.1 人間狂犬病23
• 1.3.2 家養(yǎng)動物狂犬病23-24
• 1.3.3 野生動物狂犬病24
• 1.4 狂犬病疫苗概況24-27
• 1.4.1 人用狂犬病疫苗24-25
• 1.4.1.1 神經(jīng)組織疫苗24
• 1.4.1.2 禽胚疫苗24-25
• 1.4.1.3 細胞培養(yǎng)疫苗25
• 1.4.2 獸用狂犬病疫苗25-27
• 1.4.2.1 注射用疫苗25
• 1.4.2.2 口服疫苗25-27
• 1.5 狂犬病病毒載體概況27-28
• 1.6 埃博拉病毒概況28-29
• 1.7 埃博拉出血熱流行病學(xué)概況29-30
• 1.8 埃博拉出血熱疫苗概況30
• 1.9 馬爾堡病毒概況30-31
• 1.10 馬爾堡出血熱流行病學(xué)概況31-32
• 1.11 馬爾堡出血熱疫苗概況32
• 1.12 本研究的目的和意義32-34
• 第二章 分子修飾狂犬病毒ERA疫苗株的生物學(xué)特性與.服免疫學(xué)研究34-50
• 2.1 材料與方法34-37
• 2.1.1 細胞與病毒株34
• 2.1.2 實驗動物34
• 2.1.3 主要試劑和儀器34
• 2.1.4 病毒的制備及滴定34-35
• 2.1.5 rERAG_333E株的生長動力學(xué)曲線的測定35
• 2.1.6 rERAG_333E株的遺傳穩(wěn)定性鑒定35
• 2.1.7 rERAG_333E株的致病力分析35-36
• 2.1.8 rERAG_333E株的免疫原性分析36
• 2.1.9 rERAG_333E株.服免疫BABL/c小鼠36
• 2.1.10 rERAG_333E株.服免疫比格犬36-37
• 2.1.11中和試驗37
• 2.1.12酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）37
• 2.2 結(jié)果37-47
• 2.2.1 rERAG_333E株具有與親本株相似的生長動力學(xué)37-38
• 2.2.2 rERAG_333E株糖蛋白333位點的氨基酸突變具有遺傳穩(wěn)定性38-39
• 2.2.3 G_333E突變使ERA株失去嗜神經(jīng)性及對成年BABL/c小鼠的致病力39-41
• 2.2.4 rERAG_333E株對BABL/c小鼠和比格犬肌肉接種的免疫效力41-43
• 2.2.5 rERAG_333E株.服免疫BABL/c小鼠誘導(dǎo)持久、高水平中和抗體反應(yīng)并提供完全攻毒保護43-44
• 2.2.6 rERAG_333E株.服免疫比格犬安全且能誘導(dǎo)長達三年的中和抗體和適量的唾液抗狂犬病病毒特異性IgA反應(yīng)44-47
• 2.3 討論47-50
• 第三章 狂犬病毒RERAG_333E株載體埃博拉病毒疫苗的研究50-67
• 3.1 實驗材料50-51
• 3.1.1 細胞與病毒株50
• 3.1.2 質(zhì)粒50
• 3.1.3 主要試劑和儀器50-51
• 3.1.4 實驗動物51
• 3.1.5 引物設(shè)計與合成51
• 3.2 實驗方法51-56
• 3.2.1 含扎伊爾、蘇丹埃博拉病毒野生型或密碼子優(yōu)化的GP基因的重組rERAG_333E基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建51-52
• 3.2.2 重組病毒的拯救52-53
• 3.2.3 間接免疫熒光53
• 3.2.4 種毒的制備及滴定53
• 3.2.5 Western bloting53
• 3.2.6 重組病毒生長動力學(xué)曲線的測定53-54
• 3.2.7 重組病毒遺傳穩(wěn)定性鑒定54
• 3.2.8 重組病毒對BABL/c小鼠的致病力分析54
• 3.2.9 滅活疫苗的制備54
• 3.2.10 重組病毒對BABL/c小鼠的免疫實驗54-55
• 3.2.11 中和試驗55
• 3.2.12 ELISA55-56
• 3.3 結(jié)果56-65
• 3.3.1 含ZEBOV wt-G或co-GP基因、SEBOV wt-G或co-GP基因的重組RABV基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建56
• 3.3.2 病毒的拯救56
• 3.3.3 間接免疫熒光檢測救獲的重組病毒56-58
• 3.3.4 Western bloting58
• 3.3.5 重組病毒具有與親本株相似的生長動力學(xué)58-59
• 3.3.6 重組病毒具有遺傳穩(wěn)定性59
• 3.3.7 埃博拉病毒GP基因的插入和表達沒有增強載體病毒對小鼠的致病力59-60
• 3.3.8 重組病毒不同途徑免疫BABL/c小鼠引起高水平抗狂犬病病毒和埃博拉病毒中和抗體60-63
• 3.3.9 重組病毒不同途徑免疫BABL/c小鼠引起高水平抗埃博拉GP的IgG及IgG2a反應(yīng)63-65
• 3.4 討論65-67
• 第四章 狂犬病毒RERAG_333E株載體馬爾堡病毒疫苗的研究67-78
• 4.1 實驗材料67
• 4.2 實驗方法67-70
• 4.2.1含馬爾堡病毒野生型或密碼子優(yōu)化的GP基因的重組rERAG_333E基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建67-68
• 4.2.2 重組病毒的拯救68
• 4.2.3 間接免疫熒光68-69
• 4.2.4 種毒的制備及滴定69
• 4.2.5 Western bloting69
• 4.2.6 重組病毒生長動力學(xué)曲線的測定69
• 4.2.7 重組病毒遺傳穩(wěn)定性鑒定69
• 4.2.8 滅活病毒的制備69
• 4.2.9 重組病毒對BABL/c小鼠的致病力分析69
• 4.2.10重組病毒對BABL/c小鼠的免疫69-70
• 4.2.11中和試驗70
• 4.3 結(jié)果70-76
• 4.3.1 含MBGV wt-G或co-GP基因的重組RABV基因組全長cDNA克隆的構(gòu)建70
• 4.3.2 病毒的拯救70
• 4.3.3 間接免疫熒光檢測救獲的重組病毒70-71
• 4.3.4 Western bloting71-72
• 4.3.5 重組病毒具有與親本株相似的生長動力學(xué)72-73
• 4.3.6 重組病毒具有遺傳穩(wěn)定性73
• 4.3.7 重組病毒.服和肌肉接種對小鼠均無致病力73-74
• 4.3.8 重組病毒對BABL/c小鼠的免疫效力74-76
• 4.4 討論76-78
• 第五章 全文結(jié)論78-79
• 參考文獻79-105
• 附錄105-114
• 致謝114-115
• 個人簡歷115

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 樊茂華,徐東萍;狂犬病的防治[J];湖北畜牧獸醫(yī);2004年04期

2 趙云蛟,錢愛東,李公美,姚紀元;狂犬病病毒分子流行病學(xué)研究進展[J];經(jīng)濟動物學(xué)報;2004年03期

3 林松;沒被狗咬也能感染狂犬病[J];農(nóng)村新技術(shù);2004年10期

4 陸立權(quán);郭建剛;劉棋;李華明;熊毅;鄭敏;鄒聯(lián)斌;蘭彬;蘇凱;;外觀健康家犬?dāng)y帶狂犬病病毒狀況調(diào)查[J];廣西農(nóng)業(yè)科學(xué);2006年01期

5 唐婕;金亮;李六金;;老病新談人獸共患狂犬病[J];動物保健;2006年02期

6 林家全;;常見動物疫病的診治(4) 狂犬病[J];湖南農(nóng)業(yè);2006年04期

7 劉濤;王瑞;;狂犬病的流行現(xiàn)狀及防治思考[J];現(xiàn)代畜牧獸醫(yī);2006年05期

8 高集云;;狂犬病離我們有多遠?[J];動物保健;2006年08期

9 張永振;;中國狂犬病的流行病學(xué)特征及防制建議[J];動物保健;2006年08期

10 涂長春;;我國狂犬病流行現(xiàn)狀及原因[J];動物保健;2006年08期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 丁繼超;張海林;章域震;楊衛(wèi)紅;馮云;李浩;唐青;;云南省狂犬病病毒分子流行病學(xué)研究[A];2010全國狂犬病防控高層論壇論文集[C];2010年

2 羅廷榮;;廣西狂犬病流行現(xiàn)狀[A];2010全國狂犬病防控高層論壇論文集[C];2010年

3 周鵬;徐靜東;王曉娟;趙s，

本文編號：965075