發(fā)布時間：2017-10-02 10:02

  本文關(guān)鍵詞：用RNA-seq技術(shù)鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛安全性的影響

  更多相關(guān)文章： Bt水稻 擬環(huán)紋豹蛛 毒腺 功能反應(yīng) 繁殖能力 生長發(fā)育 酶活 轉(zhuǎn)錄組

【摘要】：近年來,轉(zhuǎn)Bt基因糧食作物對害蟲的控蟲作用受到廣泛的應(yīng)用,它可以減少廣譜殺蟲劑對環(huán)境造成的污染。水稻作為亞洲國家主要的糧食作物,正面對嚴重的蟲害問題和殺蟲劑污染問題。因此,轉(zhuǎn)Bt基因水稻逐漸被用來緩解這種局勢。轉(zhuǎn)Bt基因水稻給環(huán)境與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大利益的同時,其潛在的危險同樣受到關(guān)注。Bt蛋白在稻田生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜的食物網(wǎng)中的傳遞,以及對非靶標生物的影響是人們擔(dān)憂的主要問題之一。本研究就試圖利用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)鑒定Bt水稻對稻田蜘蛛優(yōu)勢種擬環(huán)紋豹蛛(Pardosa pseudoannulata)安全性的影響。內(nèi)容具體如下：1.用RNA-seq技術(shù)鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛捕食功能及搜尋行為的影響為了探究Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛捕食功能的影響及其機理。用富集Bt蛋白的褐飛虱飼養(yǎng)擬環(huán)紋豹蛛,比較富集過Bt蛋白的擬環(huán)紋豹蛛與正常蜘蛛捕食功能以及搜尋行為差異,并解剖擬環(huán)紋豹蛛的神經(jīng)節(jié)做轉(zhuǎn)錄組分析,觀察Bt蛋白作用下神經(jīng)節(jié)基因的表達情況。同時,隨機選擇了4個DEGs基因進行了qPCR驗證。結(jié)果表明,Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛的捕食功能沒有影響,但會顯著增強擬環(huán)紋豹蛛的搜尋行為。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析,神經(jīng)細胞內(nèi)氧化磷酸化反應(yīng)顯著增強可能是擬環(huán)紋豹蛛變得興奮的關(guān)鍵因素,而其體內(nèi)一些次級代謝產(chǎn)物代謝途徑的富集可能與蜘蛛體內(nèi)對Bt蛋白的防御機制相關(guān),其轉(zhuǎn)錄組結(jié)果與qPCR驗證結(jié)果一致。2.用RNA-seq技術(shù)鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛毒腺基因表達的影響B(tài)t蛋白是一種殺蟲晶體蛋白,能與昆蟲腸道上皮細胞上的特異性蛋白結(jié)合,導(dǎo)致膜上孔洞的形成,造成昆蟲的死亡。本研究利用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù),對富集了Bt蛋白的擬環(huán)紋豹蛛毒腺與正常擬環(huán)紋豹蛛毒腺進行了深度測序,得到113358條unigene。通過比對COG, GO, KEGG等數(shù)據(jù)庫,對擬環(huán)紋豹蛛毒腺基因進行功能注釋,并且探究了在兩樣本中差異表達的基因。其中上調(diào)基因3765條,下調(diào)基因3157條,主要參與的代謝途徑為氧化磷酸化途徑、核糖體等相關(guān)途徑。本研究初步證明Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛毒腺基因表達有一定影響。同時也為全方面了解蜘蛛毒腺基因組以及基因進化提供了幫助。3.用RNA-seq技術(shù)鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛生長發(fā)育的影響為了探究Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛生長發(fā)育的影響及其機制,通過ELISA檢測來探究Bt蛋白在擬環(huán)紋豹蛛成蛛和3齡,5齡幼蛛體內(nèi)各組織中的富集規(guī)律；分別記錄實驗組和對照組幼蛛的發(fā)育歷期,體長、背甲寬、體重變化,取食量,存活率等參數(shù)；比較兩組成蛛和幼蛛體內(nèi)三大組織(肌肉組織,消化組織,神經(jīng)節(jié))及其亞細胞結(jié)構(gòu)中5種解毒酶(POD, CAT, SOD, GSH-Px, AChE)酶活的活性。取5齡幼蛛做轉(zhuǎn)錄組測序分析,通過差異表達分析和功能注釋了解Bt蛋白作用下實驗組蜘蛛差異表達基因的生物學(xué)功能,探究Bt蛋白影響幼蛛生長發(fā)育的分子機制。同時,隨機選擇了4個DEGs基因進行了qPCR驗證。結(jié)果表明,Bt蛋白可以在擬環(huán)紋豹蛛的各組織結(jié)構(gòu)和亞細胞結(jié)構(gòu)中富集,并會影響到擬環(huán)紋豹蛛的生長發(fā)育和兩種關(guān)鍵的的酶,AChE和POD。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明,幼蛛體內(nèi)一些直接調(diào)控生長發(fā)育的生物學(xué)功能的改變,如生長激素受體信號途徑,幼體發(fā)育,幼體齡期的發(fā)育,中腸的發(fā)育,體肌的發(fā)育等是造成發(fā)育顯著延遲,體重降低的主要原因；還有一些供能物質(zhì)代謝途徑的改變,如糖酵解糖異生,三羧酸循環(huán),氧化磷酸化,淀粉蔗糖的代謝,脂肪酸代謝等可能間接影響到幼蛛體內(nèi)解毒酶的活性,進而直接或間接的影響到幼蛛的生長發(fā)育。其轉(zhuǎn)錄組結(jié)果與qPCR驗證結(jié)果一致。4.用RNA-seq技術(shù)鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛繁殖的影響實驗室條件下研究了Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛繁殖能力的影響及其分子機制。以分別取食Bt水稻或正常水稻15天的褐飛虱喂食擬環(huán)紋豹蛛,比較兩組蜘蛛的繁殖能力(產(chǎn)卵前期、產(chǎn)卵量、卵袋數(shù)、孵化率)是否有差異,在宏觀層面上探究Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛繁殖能力的影響；取蜘蛛性腺做轉(zhuǎn)錄組分析,研究性腺中繁殖相關(guān)基因的表達是否受到影響,從分子層面上解釋Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛的作用機制。同時,我們對8個卵黃蛋白基因進行了qPCR驗證。結(jié)果表明,Bt蛋白可以沿著食物鏈傳遞,從水稻通過褐飛虱在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)富集,其最大富集量為0.396ng/g,而擬環(huán)紋豹蛛的繁殖能力不受Bt蛋白的影響�；虿町惐磉_分析顯示,性腺中直接調(diào)控繁殖的有806個unigene,這些unigene參與到23種不同的生物學(xué)功能和4條代謝途徑,且都沒有差異表達；而以FDR0.01, log2fold change2篩選得到的49個顯著差異表達基因參與到的生物學(xué)功能和代謝途徑都不與蜘蛛的繁殖直接相關(guān)。在Cry1Ab蛋白脅迫下,8個與卵黃蛋白合成相關(guān)的基因均未發(fā)生表達差異,其轉(zhuǎn)錄組結(jié)果與qPCR驗證結(jié)果一致。因此,Bt蛋白不影響擬環(huán)紋豹蛛的繁殖能力,其主要原因是性腺中繁殖相關(guān)基因的表達并沒有受到影響。
【關(guān)鍵詞】：Bt水稻 擬環(huán)紋豹蛛 毒腺 功能反應(yīng) 繁殖能力 生長發(fā)育 酶活 轉(zhuǎn)錄組
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S476.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第一章 緒論14-26
• 1 問題的提出14-15
• 2 轉(zhuǎn)Bt基因作物15-23
• 2.1 Bt蛋白簡介15-16
• 2.2 轉(zhuǎn)Bt基因作物16-17
• 2.3 轉(zhuǎn)Bt基因作物對靶標生物影響的研究17-19
• 2.4 轉(zhuǎn)Bt基因作物對非靶標生物影響的研究19-23
• 3 蜘蛛23-24
• 4 轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)(RNA-seq技術(shù))24-26
• 第二章 用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛捕食功能及搜尋行為的影響26-39
• 1 材料與方法26-28
• 1.1 實驗用水稻26
• 1.2 供試褐飛虱26
• 1.3 實驗用蜘蛛及其處理26
• 1.4 Bt蛋白含量測定26-27
• 1.5 捕食功能反應(yīng)27
• 1.6 搜尋反應(yīng)27
• 1.7 轉(zhuǎn)錄組測序27
• 1.8 qPCR分析(實時熒光定量PCR)27-28
• 1.9 數(shù)據(jù)處理28
• 2 結(jié)果與分析28-36
• 2.1 擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)Cry1Ab蛋白含量隨天數(shù)變化28-29
• 2.2 捕食功能反應(yīng)29-30
• 2.3 搜尋反應(yīng)30
• 2.4 轉(zhuǎn)錄組Unigene差異分析30-35
• 2.5 DEGs基因的qPCR分析35-36
• 3 結(jié)論與討論36-39
• 第三章 用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛毒腺基因表達的影響39-48
• 1 材料與方法39-41
• 1.1 實驗水稻39
• 1.2 稻飛虱養(yǎng)殖39
• 1.3 蜘蛛采集和分裝39
• 1.4 試劑及試劑盒39-40
• 1.5 蜘蛛的飼養(yǎng)40
• 1.6 Bt蛋白檢測40
• 1.7 蜘蛛毒腺解剖40
• 1.8 RNA的提取40-41
• 1.9 RNA質(zhì)量檢測41
• 1.10 測序41
• 1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計41
• 2 結(jié)果與分析41-46
• 2.1 蜘蛛體內(nèi)Bt蛋白含量41
• 2.2 擬環(huán)紋豹蛛的毒腺41
• 2.3 RNA質(zhì)量檢測41-42
• 2.4 差異表達分析42-46
• 3 討論46-48
• 第四章 用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛生長發(fā)育的影響48-67
• 1 材料與方法49-51
• 1.1 供試水稻49
• 1.2 供試飛虱49
• 1.3 供試蜘蛛49
• 1.4 CrylAb蛋白檢測49-50
• 1.5 酶活的測定50
• 1.6 轉(zhuǎn)錄組分析50
• 1.7 qPCR分析50
• 1.8 數(shù)據(jù)分析50-51
• 2 結(jié)果與分析51-64
• 2.1 Cry1Ab蛋白在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的生物富集51
• 2.2 Cry1Ab蛋白對幼蛛發(fā)育歷期、存活率和體重增長的影響51-53
• 2.3 Cry1Ab蛋白對幼蛛身體發(fā)育的影響53-54
• 2.4 Cry1Ab蛋白對成蛛體內(nèi)各組織以及其亞細胞結(jié)構(gòu)中各酶活的影響54-57
• 2.5 Cry1Ab蛋白對幼蛛體內(nèi)各組織及亞細胞結(jié)構(gòu)中各酶活的影響57-59
• 2.6 轉(zhuǎn)錄組結(jié)果分析59-63
• 2.7 DEGs基因的qPCR分析63-64
• 3. 討論64-67
• 第五章 用轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)鑒定Bt蛋白對擬環(huán)紋豹蛛繁殖的影響67-80
• 1 材料與方法68-70
• 1.1 水稻68
• 1.2 褐飛虱68
• 1.3 蜘蛛的飼養(yǎng)68
• 1.4 Cry1Ab的檢測68-69
• 1.5 基因表達分析與功能注釋69
• 1.6 qPCR檢測69-70
• 1.7. 數(shù)據(jù)分析70
• 2 結(jié)果與分析70-76
• 2.1 Cry1Ab蛋白在擬環(huán)紋豹蛛體內(nèi)的富集規(guī)律70-71
• 2.2 Cry1Ab蛋白對擬環(huán)紋豹蛛繁殖能力的影響71
• 2.3 基因表達分析71-75
• 2.4 卵黃蛋白基因的qPCR分析75-76
• 3 討論76-80
• 第六章 結(jié)論、創(chuàng)新與展望80-82
• 1 結(jié)論80
• 2 創(chuàng)新點80-81
• 3 展望81-82
• 參考文獻82-98
• 附錄A：RNA質(zhì)檢結(jié)果98-100
• 附錄B：轉(zhuǎn)錄組建庫流程及Reads質(zhì)量預(yù)處理100-103
• 附錄C103-105
• 致謝105-106

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