本文關(guān)鍵詞：程序性細(xì)胞死亡與沉香倍半萜次生代謝關(guān)系的探索研究

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【摘要】：國(guó)產(chǎn)沉香為瑞香科白木香Aquilaria sinensis (Lour.) Gilg含樹(shù)脂的木材,為著名的芳香南藥,同時(shí)在香料、化工、宗教、工藝品等有廣泛應(yīng)用。白木香野生資源主要分布于海南、廣東、廣西、云南、福建等地。因伐樹(shù)結(jié)香,目前白木香的野生資源幾乎破壞殆盡,1999年被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物,2000年被列入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟受威脅植物紅色名錄》,2004年已被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)附錄Ⅱ。目前中國(guó)已種植的白木香林超過(guò)3000萬(wàn)株,迫切需要高效的結(jié)香技術(shù)。近年來(lái),魏建和團(tuán)隊(duì)發(fā)明的“通體結(jié)香”技術(shù)已開(kāi)始在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用,并獲得了較好的結(jié)香效果。傷害誘導(dǎo)白木香防御反應(yīng)形成沉香的機(jī)制已得到初步揭示,但沉香形成的機(jī)制,特別是初始傷害后沉香持續(xù)形成的分子機(jī)制尚未清晰闡明,制約了通體結(jié)香技術(shù)的改進(jìn)及更優(yōu)方法的發(fā)明。本論文首次較系統(tǒng)地研究了程序性細(xì)胞死亡(PCD, programmed cell death)與沉香倍半萜形成的關(guān)系,以探索PCD與沉香形成,特別是持續(xù)結(jié)香的關(guān)系。1、構(gòu)建了體系均二穩(wěn)定、細(xì)胞活力良好的白木香懸浮細(xì)胞體系,健康體系未檢測(cè)到倍半萜a-愈創(chuàng)木烯(α-guaiene)、α-蛇麻烯(α-humulene和δ-愈創(chuàng)木烯(δ-guaiene),但MeJA可誘導(dǎo)其產(chǎn)生倍半萜,表明懸浮細(xì)胞體系可作為結(jié)香機(jī)制研究的離體材料。采用莖尖誘導(dǎo)愈傷組織,最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg-L·1 NAA+1.0 mg-L·16-BA;經(jīng)12次繼代培養(yǎng)的愈傷組織生長(zhǎng)旺盛、質(zhì)地疏松適于懸浮培養(yǎng);將其置于液體培養(yǎng)基MS+2.0 mg·L~(-1) NAA+1.0 mg·L~(-1) 6-BA+500.0 mg·L~(-1) CH中震蕩培養(yǎng),建成懸浮細(xì)胞體系。懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S型,初期增長(zhǎng)緩慢,4-6 d為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,7~(-1)2 d進(jìn)入平臺(tái)期,12d以后細(xì)胞生長(zhǎng)速度及活力下降；GC-MS分析結(jié)果顯示,培養(yǎng)0d、3d、6d、2d懸浮細(xì)胞未檢測(cè)到倍半萜α-guaiene、α-humulene、 δ-guaiene,使用100μMMeJA處理24 h可明顯檢測(cè)到這三種倍半萜。PCD檢測(cè)結(jié)果表明,懸浮細(xì)胞培養(yǎng)到24 d后發(fā)生PCD；熒光定量PCR檢測(cè)倍半萜誘導(dǎo)結(jié)果表明,懸浮培養(yǎng)到24 d后倍半萜合成相關(guān)基因表達(dá)明顯提高,說(shuō)明生長(zhǎng)后期的懸浮細(xì)胞不可用于結(jié)香機(jī)制研究。因此,本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的白木香懸浮細(xì)胞體系在7~(-1)2 d可作為研究傷害誘導(dǎo)白木香防御反應(yīng)形成沉香機(jī)制的離體材料。2、首次克隆了沉香倍半萜合成途徑的AsAACT、AsHMGS、AsHD及 AsDXR 4個(gè)基因全長(zhǎng),為檢測(cè)倍半萜合成提供參考指標(biāo)。本課題對(duì)沉香倍半萜合成的4個(gè)關(guān)鍵酶基因AsAACT、AsHMGS、AsDXR、AsHDR進(jìn)行全長(zhǎng)克隆、生物信息學(xué)分析。運(yùn)用熒光定量PCR對(duì)茉莉酸甲酯MeJA及水楊酸SA誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞的關(guān)鍵基因AsAACT、AsHMGS、AsHMGR、AsDXS、AsDXR、AsHDR、AsFPS、ASS1、及ASS2表達(dá)進(jìn)行分析,運(yùn)用基因表達(dá)譜對(duì)火烙法、接菌法與輸液法處理的白木香轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,最終篩選到AsAACT、AsFPS、ASS1、ASS2為特異表達(dá)基因,可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)誘導(dǎo)型倍半萜的參考指標(biāo)。3、H2O2脅迫可以明顯誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞PCD,生成少量的α-guaiene、 α-humulene、δ-guaiene。H2O2處理后3h發(fā)生PCD,6~(-1)2 h出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核皺縮及DNA降解,24 hMCP1、MCP2、Cyt-c表達(dá)明顯調(diào)高,48 h細(xì)胞核變?yōu)楹诵◇w；采用GC-MS檢測(cè)、峰面積歸一化法計(jì)算,得出三種倍半萜的相對(duì)百分含量,H_20_2處理后3h僅檢測(cè)到0.058% α-humulene,6hFPS、ASS1、ASS2表達(dá)明顯上調(diào),12h可檢測(cè)到0.244% α-humulene 與 0.521% δ-guaiene,24 h可檢測(cè)到0.157% α-guaiene、 0.373% α-humulene、1.297%δ-guaiene。4、MeJA也可以明顯誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞發(fā)生PCD,生成較大量的α-guaiene、 α-humulene、δ-guaiene。(1)采用2.5 μM～25 μM MeJA處理懸浮細(xì)胞,96h內(nèi)細(xì)胞死亡率無(wú)明顯變化,但采用TUNEL法可檢測(cè)到陽(yáng)性細(xì)胞,說(shuō)明懸浮細(xì)胞發(fā)生了PCD但尚未死亡；MeJA處理后12 h,三種倍半萜總量最高,2.5μM和25μM MeJA處理分別達(dá)86.098%、71.825%,之后倍半萜量下降,48 h分別下降到31.993%、20.908%；(2)采用50μM～100μMMeJA處理,12h～96h細(xì)胞死亡率顯著升高,TUNEL檢測(cè)處理后懸浮細(xì)胞3h～6h呈弱陽(yáng)性、24 h～96h呈陽(yáng)性；三種倍半萜總量在12h～24 h最高,50μM和100μM MeJA處理分別達(dá)93.884%、89.037%,之后總量一直保持在71%以上；(3)采用250μM～500μM MeJA處理,在12h～96 h細(xì)胞死亡率顯著升高,TUNEL檢測(cè)處理后懸浮細(xì)胞3h呈弱陽(yáng)性、96h呈陽(yáng)性；三種倍半萜總量在24 h最高,250μM和500μM MeJA處理分別達(dá)90.197%、76.335%,之后總量一直保持在58%以上；(4)相關(guān)性分析表明,細(xì)胞死亡率與倍半萜濃度呈顯著正相關(guān),說(shuō)明MeJA處理后懸浮細(xì)胞發(fā)生的PCD很可能由倍半萜誘導(dǎo)；(5)Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可一定程度減緩懸浮細(xì)胞發(fā)生PCD的進(jìn)程,但不能阻止,對(duì)倍半萜合成關(guān)鍵基因有下調(diào)趨勢(shì),反向證明PCD對(duì)倍半萜具有正向促進(jìn)作用。5、愈創(chuàng)木烯型倍半萜guaiene及α-humulene能誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞的PCD,說(shuō)明初始傷害后誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞生成的倍半萜可能會(huì)產(chǎn)生類似二次傷害的作用,進(jìn)二步推動(dòng)PCD的發(fā)生。guaiene、α-humulene處理健康的白木香懸浮細(xì)胞,可檢測(cè)到PCD, guaiene比α-humulene更容易誘導(dǎo)PCD；隨著倍半萜濃度增加、處理時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞死亡率升高,TUNEL的熒光強(qiáng)度增大、PCD關(guān)鍵基因的表達(dá)上調(diào)。本研究采用白木香懸浮細(xì)胞體系探索了程序性細(xì)胞死亡與沉香倍半萜的關(guān)系。通過(guò)研究初步闡明傷害脅迫H202及MeJA可以誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞PCD與沉香倍半萜合成,誘導(dǎo)的倍半萜類成分guaiene、α-humulene能進(jìn)一步推動(dòng)PCD的發(fā)生。離體研究結(jié)果為揭示白木香受到傷害后誘導(dǎo)形成沉香的機(jī)制,特別是沉香持續(xù)形成的機(jī)制提供了新的數(shù)據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：白木香 倍半萜 沉香 程序性細(xì)胞死亡 結(jié)香機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S567.19
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 文獻(xiàn)綜述12-38
• 一、沉香結(jié)香機(jī)制的研究概況12-14
• 二、植物萜類次生代謝調(diào)控的研究進(jìn)展14-22
• 三、脅迫誘導(dǎo)植物程序性細(xì)胞死亡的研究進(jìn)展22-26
• References26-38
• 前言38-41
• References39-41
• 論文研究?jī)?nèi)容框架41-42
• 第一章 沉香木分層中的細(xì)胞存活狀態(tài)及倍半萜分布42-52
• References47-52
• 第二章 白木香懸浮細(xì)胞體系的構(gòu)建52-70
• 一、白木香懸浮細(xì)胞體系的構(gòu)建及其可應(yīng)用性評(píng)價(jià)52-60
• 二、生長(zhǎng)后期白木香懸浮細(xì)胞PCD發(fā)生與倍半萜合成研究60-68
• References68-70
• 第三章 白木香倍半萜合成途徑中四個(gè)關(guān)鍵酶基因AsAACT、AsHMGS、AsDXR、AsHDR的克隆及表達(dá)70-96
• 一、白木香倍半萜合成途徑中四個(gè)關(guān)鍵基因AsAACT、AsHMGS、AsDXR、AsHDR的克隆與分析70-88
• 二、白木香倍半萜合成AsAACT、AsHMGS、AsDXR、AsHDR及其它5個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)分析88-93
• References93-96
• 第四章 H_2O_2脅迫下白木香懸浮細(xì)胞PCD與倍半萜合成關(guān)系的研究96-104
• References102-104
• 第五章 MeJA誘導(dǎo)下白木香懸浮細(xì)胞PCD與倍半萜合成關(guān)系的研究104-122
• 一、MeJA誘導(dǎo)下白木香懸浮細(xì)胞PCD與倍半萜生成的關(guān)系104-116
• 三、Caspase抑制劑初探白木香懸浮細(xì)胞PCD與倍半萜的關(guān)系116-120
• References120-122
• 第六章 倍半萜誘導(dǎo)白木香懸浮細(xì)胞PCD的研究122-128
• References127-128
• 結(jié)語(yǔ)128-130
• 致謝130-132
• 作者情況介紹13

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本文編號(hào)：956390