本文關(guān)鍵詞：產(chǎn)氣莢膜梭菌B型C58-1株α、β1和ε毒素的高效表達(dá)與免疫效力評(píng)價(jià)及生產(chǎn)工藝改進(jìn)

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【摘要】：產(chǎn)氣莢膜梭菌,又名魏氏梭菌,能引起人類(lèi)氣性壞疽和多種動(dòng)物的壞死性腸炎及腸毒血癥,是近年來(lái)導(dǎo)致我國(guó)家畜“猝死癥”的主要病原。利用梭菌培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的毒素可實(shí)現(xiàn)梭菌性疾病的有效免疫,因此,培養(yǎng)此類(lèi)細(xì)菌,獲得高濃度、強(qiáng)毒力的毒素,可制備免疫效果優(yōu)良的疫苗。羊三聯(lián)四防滅活疫苗(羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥)就是其中之一,在我國(guó)被廣泛使用。目前專(zhuān)業(yè)疫苗公司在培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌生產(chǎn)中大多使用厭氣肉肝胃酶消化湯作為培養(yǎng)基,該培養(yǎng)基需要牛肉、肝、胃蛋白酶等原材料,產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)成本非常高。另一方面,受到上述原材料品質(zhì)的影響(如肉品的新鮮度、抗生素的殘留等),培養(yǎng)基質(zhì)量不易掌控,進(jìn)而影響到成品疫苗質(zhì)量的穩(wěn)定性。其次,常規(guī)苗需大劑量免疫(5 m L/只),且免疫副反應(yīng)較重。本研究克隆表達(dá)產(chǎn)氣莢膜梭菌C58-1株α、β1、ε和β1-ε四種毒素蛋白,并通過(guò)小鼠和家兔的免疫保護(hù)試驗(yàn)驗(yàn)證這四種毒素蛋白作為亞單位疫苗的可能性;同時(shí),優(yōu)化了具有良好免疫保護(hù)力蛋白的高效表達(dá)條件,實(shí)現(xiàn)其工程化制備。我們克隆了產(chǎn)氣莢膜梭菌C58-1株α、β1、ε和β1-ε基因片段,分別構(gòu)建了表達(dá)載體p ETα765、p ETβ1927、p ETε984和p ET1947,并在大腸桿菌BL21獲得高效表達(dá)。通過(guò)Western blotting檢測(cè)證明表達(dá)的四種毒素蛋白均能夠與特異的抗體反應(yīng),具有良好的反應(yīng)原性。同時(shí)對(duì)克隆的C58-1株α、β1、ε和β1-ε基因片段序列進(jìn)行了分析。α毒素序列與目前所有的A-E型產(chǎn)氣莢膜梭菌同源性在61%-100%之間。其中,C58-1株α毒素蛋白序列與C型同源性最低(61%),與B-E型同源性為98%-100%,α毒素在產(chǎn)氣莢膜梭菌B-E型中具有相同或相似的功能。β1毒素蛋白序列與所有的B型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌具有較高的同源性,其同源性在99.4%-100%之間。ε毒素蛋白序列與所有的B型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌具有較高的同源性,其同源性在99.7%-100%之間,產(chǎn)氣莢膜梭菌的B型和D型的ε毒素蛋白具有相同或相似的生物學(xué)功能,包括免疫學(xué)特性。在α、β1、ε和β1-ε四種毒素蛋白對(duì)動(dòng)物免疫保護(hù)研究實(shí)驗(yàn)中,α和β1毒素蛋白無(wú)法完全保護(hù)注射致死劑量毒素的小鼠,ε和β1-ε毒素蛋白對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌B型和D型提供的免疫保護(hù)優(yōu)于全菌疫苗,其中β1-ε毒素蛋白對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌B型、C型、D型均具有保護(hù)力。根據(jù)中華人民共和國(guó)獸藥典獸醫(yī)生物制品制造與檢驗(yàn)規(guī)程,借鑒羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥三聯(lián)四防滅活疫苗的制造及檢驗(yàn)規(guī)程,采用血清中和法對(duì)β1-ε類(lèi)毒素疫苗進(jìn)行效力檢驗(yàn),結(jié)果證實(shí)完全符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)�；谝宜岷铣膳c蛋白誘導(dǎo)表達(dá)機(jī)制,降低乙酸積累量能夠顯著提高大腸桿菌表達(dá)β1-ε毒素蛋白的水平�？疾炝藀 H值、溶氧水平對(duì)β1-ε毒素蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果表明,p H值控制在6.5(0-6 h)、7.0(6-16 h)及溶氧水平控制在60%(0-6 h)、30%(6-16 h)時(shí),可顯著降低乙酸的積累量,提高菌體生物量及β1-ε毒素蛋白表達(dá)量。另外,考察了間歇補(bǔ)料、溶氧反饋補(bǔ)料、p H值反饋補(bǔ)料及恒葡萄糖濃度補(bǔ)料對(duì)β1-ε毒素蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果表明在采用分階段p H值及溶氧控制策略且結(jié)合溶氧反饋控制補(bǔ)料時(shí),菌體濃度(OD600為2.045)及β1-ε毒素蛋白表達(dá)量(63.24 mg/L)最高,乙酸積累量降低至0.872 g/L。通過(guò)對(duì)發(fā)酵參數(shù)篩選及發(fā)酵過(guò)程控制,降低了乙酸積累量,為實(shí)現(xiàn)β1-ε毒素蛋白的工程化制備奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：產(chǎn)氣莢膜梭菌B型 α毒素基因 β1毒素基因 ε毒素基因 高效表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮略詞表11-12
• 第一篇 文獻(xiàn)綜述12-34
• 1 產(chǎn)氣莢膜梭菌研究進(jìn)展12-18
• 1.1 病原學(xué)12
• 1.2 生物學(xué)特性12-13
• 1.3 B型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要毒素的研究進(jìn)展13-18
• 2 產(chǎn)氣莢膜梭菌病流行情況研究進(jìn)展18-24
• 2.1 影響產(chǎn)氣莢膜梭菌病流行的因素18-23
• 2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌病的流行情況23-24
• 3 產(chǎn)氣莢膜梭菌病防治研究進(jìn)展24-34
• 3.1 微生態(tài)制劑24-25
• 3.2 益生素25-27
• 3.3 植物提取物和香精油27
• 3.4 有機(jī)酸27-28
• 3.5 噬菌體、溶菌酶和抗菌肽28-29
• 3.6 疫苗29-32
• 3.7 本項(xiàng)目研究的目的和意義32-34
• 第二篇 研究?jī)?nèi)容34-100
• 第1章 產(chǎn)氣莢膜梭菌B型 α 毒素基因序列分析與克隆表達(dá)34-52
• 1.1 材料與方法35-40
• 1.2 結(jié)果40-49
• 1.3 討論49-50
• 1.4 小結(jié)50-52
• 第2章 產(chǎn)氣莢膜梭菌B型 β1 毒素基因序列分析與克隆表達(dá)52-64
• 2.1 材料與方法52-55
• 2.2 結(jié)果55-62
• 2.3 討論62-63
• 2.4 小結(jié)63-64
• 第3章 產(chǎn)氣莢膜梭菌B型 ε 毒素基因序列分析與克隆表達(dá)64-72
• 3.1 材料與方法64-67
• 3.2 結(jié)果67-71
• 3.3 討論71
• 3.4 小結(jié)71-72
• 第4章 產(chǎn)氣莢膜梭菌B型 β1-ε 毒素基因表達(dá)72-78
• 4.1 材料與方法72-74
• 4.2 結(jié)果74-77
• 4.3 討論77
• 4.4 小結(jié)77-78
• 第5章 α、β1、ε、β1-ε 四種類(lèi)毒素疫苗對(duì)動(dòng)物免疫保護(hù)研究78-88
• 5.1 材料和方法79-82
• 5.2 結(jié)果82-85
• 5.3 討論85-86
• 5.4 小結(jié)86-88
• 第6章 C58-1 株 β1-ε 蛋白高效表達(dá)培養(yǎng)條件的優(yōu)化88-100
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料90-92
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法92-94
• 6.3 結(jié)果與討論94-99
• 6.4 小結(jié)99-100
• 結(jié)論100-102
• 創(chuàng)新點(diǎn)102-104
• 參考文獻(xiàn)104-120
• 導(dǎo)師簡(jiǎn)介120-123
• 作者簡(jiǎn)介123-124
• 致謝124

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本文編號(hào)：884760