本文關(guān)鍵詞：菌齡對核盤菌致病性的影響及植物抗核盤菌分子機制

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【摘要】：核盤菌(sclerotinia sclerotioru)行)是一種在世界范圍內(nèi)廣泛分布的死體營養(yǎng)型病原真菌。核盤菌引起的菌核病是油料和蔬菜作物的重要病害。草酸和細胞壁降解酶是核盤菌重要致病因子。核盤菌生長過程中當(dāng)遇到不利條件時會產(chǎn)生氣生菌絲并形成菌核,核盤菌菌絲形態(tài)的分化使其致病力發(fā)生很大變化。但具體機制尚不清楚。目前對植物抗核盤菌機制的理解仍很膚淺,抗核盤菌調(diào)控新基因的鑒定急需開展,作為核盤菌的非寄主植物的水稻與核盤菌的互作或許會為核盤菌抗性研究提供新的發(fā)現(xiàn)。本研究圍繞植物與核盤菌的互作機理,解析菌齡影響核盤菌致病力的分子機制、闡明植物鈣離子信號通路在抗核盤菌中的作用、采用本氏煙cDNA文庫-VIGS篩選技術(shù),獲取抗核盤菌調(diào)控新基因,并初步揭示水稻與核盤菌的非寄主互作分子機制,獲得了如下結(jié)果： (1)明確了核盤菌菌絲形態(tài)分化與致病力的關(guān)系,解釋了富含氣生菌絲的老熟菌絲致病力下降的原因。核盤菌平板培養(yǎng)時老熟菌絲上會有大量氣生菌絲產(chǎn)生,顯微觀察發(fā)現(xiàn)氣生菌絲直徑明顯比幼嫩菌絲小,只有幼嫩菌絲的1/5左右。與新生菌絲(菌齡為0d的幼嫩菌絲)相比,1d-3d菌齡的老熟菌絲致病力明顯下降。進一步分析顯示,老熟菌絲中草酸合成關(guān)鍵基因OAH的表達明顯低于幼嫩菌絲,而且老熟菌絲產(chǎn)草酸的能力顯著下降。外源施加草酸(10mM,pH7.0)部分恢復(fù)老熟菌絲的致病力。這些結(jié)果證明草酸分泌的降低導(dǎo)致了老熟菌絲致病力的下降。此外,1d-3d老熟菌絲中超氧陰離子和過氧化氫含量低于0d菌齡的菌絲,這與活性氧代謝相關(guān)基因的表達結(jié)果相對應(yīng)。另外,RNAi分析結(jié)果表明,微管相關(guān)蛋白EB1基因的沉默減弱生長發(fā)育和菌核形成,致病力也明顯下降。顯示EB1基因在核盤菌生長發(fā)育、菌核形成和致病性中的重要作用。 (2)揭示了鈣離子信號途徑和AtWRKY11基因在植物抗核盤菌中的作用。采用芯片表達譜技術(shù)比較分析了接種核盤菌前后油菜葉片的基因表達譜,發(fā)現(xiàn)有1072個差異表達在2倍以上的基因,其中接種后上調(diào)表達基因531個,下調(diào)表達基因541個。差異表達基因中有15個與鈣離子信號通路相關(guān)。藥理學(xué)研究結(jié)果顯示,鈣離子通道抑制劑氯化鑭(LaCl3,1mmol/L)和鈣泵抑制劑偏釩酸鈉(NaVO3,50μmol/L)處理降低了本氏煙對核盤菌的抗性,而CaCl2(10mmol/L)處理則增強該抗性。這些調(diào)節(jié)劑的處理顯著誘導(dǎo)包括AtWRKY11在內(nèi)的一組鈣離子信號傳導(dǎo)基因的表達。擬南芥wrkyll突變體對核盤菌抗性顯著下降。這些結(jié)果證明了鈣離子信號通路對植物抗核盤菌起重要調(diào)控作用。 (3)在基因組水平鑒定了番茄鈣離子依賴的蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)和CDPK-related protein kinase (CRK)基因家族,并采用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus induced gene silencing, VIGS)技術(shù)分析明確了SlCDPK和SlCRK基因?qū)吮P菌抗性的重要調(diào)控作用。采用生物信息學(xué)方法鑒定了29個番茄CDPK基因和6個CRK基因。所有SlCDPK蛋白都包含一個STKc_CAMK類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和兩個EF-hand類鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域,所有SlCRK僅僅在N端包含一個STKc_CAMK類的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域,而C端不含有保守的Ca2+結(jié)合位點。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)番茄CDPK家族分為4個組。其中第Ⅳ組SlCDPKs比較特珠,它們是堿性蛋白并有11個內(nèi)含子。VIGS分析顯示,SlCRK6同時參與了對核盤菌和Psedomonas syringae pv. tomato DC3000(Pst DC3000)的抗性調(diào)控；而SlCDPK10和SlCDPK18基因?qū)吮P菌抗性沒有顯著調(diào)控作用,但分別正調(diào)控對Pst DC3000口Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)的抗性。這些結(jié)果說明,SlCDPK和SlCRK廣泛參與對各種病害抗性的調(diào)控,且不同抗性有不同的基因參與。另外,酵母雙雜交分析結(jié)果表明,SlCDPK12與S1CaML蛋白互作。 (4)采用本氏煙cDNA文庫VIGS篩選方法,篩選鑒定了一批草酸耐性和核盤菌抗性調(diào)控基因。從構(gòu)建的文庫中挑取了511個基因進行VIGS分析,一共篩選獲取了71個草酸耐性調(diào)控基因和63個核盤菌抗性調(diào)控基因,其中,Upstream activation factor subunit UAF30(編號437)和Translationally-controlled tumor protein (編號502)等基因的沉默植株對草酸耐受力減弱,對核盤菌的抗性也減弱,而Aspartic proteinase oryzasin-1(編號135)等基因的沉默植株對草酸的耐受力增強,對核盤菌抗性也增強。說明這些基因?qū)Σ菟峤閷?dǎo)的植物與核盤菌互作起重要調(diào)控作用。有些基因只涉及對草酸耐性或核盤菌抗性的調(diào)控,說明植物對核盤菌的抗性除了草酸外還有別的途徑。 (5)建立了水稻與核盤菌的非寄主抗性互作體系,初步明確了該非寄主互作的調(diào)控機制。核盤菌野生型1980菌株接種24h后水稻葉片產(chǎn)生肉眼可見的類似HR反應(yīng)的褐色壞死小斑點。褐色斑點內(nèi)有大量活性氧積累,核盤菌被限制在壞死區(qū)域無法擴展。而不致病的PB菌株接種后水稻葉片沒有產(chǎn)生類似反應(yīng)。利用TMT標(biāo)記方法對接種核盤菌的水稻葉片蛋白表達進行定量分析。對接種野生型1980菌株與不致病的PB菌株之間、以及PB菌株接種與不接種之間的水稻葉片差異表達蛋白分析結(jié)果表明,以下蛋白可能參與對核盤菌抗性的調(diào)控：P-protein; Proline-rich-like protein; ribonuclease T2family protein; Eukaryotic translation initiation factor3; RALFL4(Rapid ALkalinization Factor RALF family protein); lrgB-like family protein和CHIT14(Chitinase family protein)以及一組氧化還原調(diào)節(jié)蛋白。其中RALFL4具有堿化作用,而CHIT14能夠降解真菌細胞壁幾丁質(zhì)。該結(jié)果揭示維持酸性環(huán)境是非寄主抗性產(chǎn)生所必需。此外,差異表達的Eukaryotic translation initiation factor3為泛素化蛋白。說明泛素化參與對核盤菌抗性的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：核盤菌 菌齡 致病性 草酸 鈣離子信號通路 AtWRKY11 CDPK CRK 抗病性 基因沉默 非寄主抗性 水稻 定量蛋白質(zhì)組學(xué) 本氏煙 文庫VIGS
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S432.44
【目錄】：

• 致謝7-8
• 摘要8-11
• Abstract11-14
• 目錄14-17
• 第一章 文獻綜述17-40
• 1.1 引言17
• 1.2 核盤菌與植物菌核病17-18
• 1.2.1 核盤菌及其生物學(xué)特性17-18
• 1.2.2 植物菌核病18
• 1.3 核盤菌侵染植物的過程及方式18-19
• 1.4 核盤菌與植物互作機理研究進展19-31
• 1.4.1 核盤菌致病因子鑒定及致病機理研究進展20-26
• 1.4.2 植物抗核盤菌機理研究進展26-31
• 1.5 植物鈣離子信號通路及CDPK和CRK基因家族在抗病中的研究進展31-36
• 1.5.1 植物鈣離子信號通路在抗病中的研究進展31-34
• 1.5.2 植物CDPK和CRK基因家族在抗病中的研究進展34-36
• 1.6 植物非寄主抗性研究進展36-38
• 1.7 本研究的目的意義及內(nèi)容38-40
• 第二章 核盤菌不同菌齡菌絲的形態(tài)分化對其致病力的影響40-70
• 2.1 前言40
• 2.2 材料與方法40-47
• 2.2.1 材料40-41
• 2.2.2 方法41-47
• 2.3 結(jié)果與分析47-68
• 2.3.1 不同菌齡核盤菌菌絲致病力存在顯著差異47-48
• 2.3.2 草酸(OA)在不同菌齡菌絲中含量差異及其對致病力的影響48-54
• 2.3.3 不同菌齡核盤菌菌絲內(nèi)ROS含量變化及相關(guān)基因表達差異54-59
• 2.3.4 不同菌齡菌絲差異表達蛋白基因表達檢測59-61
• 2.3.5 不同菌齡菌絲差異表達蛋白基因EB1的RNAi功能分析61-64
• 2.3.6 核盤菌不同菌齡菌絲組成和形態(tài)差異的顯微觀察64-68
• 2.4 討論68-70
• 第三章 鈣離子信號途徑和AtWRKY11基因在植物抗核盤菌中的作用分析70-81
• 3.1 前言70
• 3.2 材料與方法70-72
• 3.2.1 材料70
• 3.2.2 方法70-72
• 3.3 結(jié)果與分析72-79
• 3.3.1 油菜接種核盤菌后的基因表達譜分析揭示許多鈣離子信號通路基因在核盤菌接種前后顯著差異表達的表達譜分析72-74
• 3.3.2 鈣離子信號通路在植物抗核盤菌中的藥理學(xué)分析74-76
• 3.3.3 核盤菌接種改變了擬南芥鈣離子信號途徑相關(guān)基因的表達76-78
• 3.3.4 鈣離子信號通路相關(guān)基因wrkyll在擬南芥與核盤菌互作中的作用78-79
• 3.4 討論79-81
• 第四章 番茄CDPK和CRK基因家族鑒定及其抗病功能分析81-105
• 4.1 前言81
• 4.2 材料與方法81-88
• 4.2.1 材料81-83
• 4.2.2 方法83-88
• 4.3 結(jié)果與分析88-102
• 4.3.1 番茄CDPK和CRK基因家族的鑒定與分析88-97
• 4.3.2 SlCDPK與SlCRK基因的抗病調(diào)控功能的VIGS分析97-100
• 4.3.3 SlCDPK和SlCRK與SlRboh2和SlCaM互作的酵母雙雜交分析100-102
• 4.4 討論102-105
• 第五章 本氏煙抗核盤菌調(diào)控基因的文庫基因沉默初篩105-115
• 5.1 前言105
• 5.2 材料與方法105-106
• 5.2.1 材料105
• 5.2.2 方法105-106
• 5.3 結(jié)果與分析106-114
• 5.3.1 基因沉默植株對草酸耐受力和核盤菌的抗性檢測106-108
• 5.3.2 參與本氏煙與核盤菌互作的部分基因的鑒定108-114
• 5.4 討論114-115
• 第六章 核盤菌與水稻的非寄主抗性互作體系的建立115-140
• 6.1 前言115
• 6.2 材料與方法115-118
• 6.2.1 材料115-116
• 6.2.2 方法116-118
• 6.2.3 數(shù)據(jù)分析118
• 6.3 結(jié)果與分析118-138
• 6.3.1 水稻接種核盤菌后的癥狀觀察118-120
• 6.3.2 接種核盤菌后水稻ROS產(chǎn)生情況檢測120-122
• 6.3.3 接種核盤菌后水稻HR壞死的臺盼藍染色檢測122-123
• 6.3.4 核盤菌菌株1980和PB接種后水稻葉片蛋白表達的比較分析123-138
• 6.4 討論138-140
• 第七章 全文小結(jié)140-143
• 參考文獻143-155
• 附表155-158
• 附錄 作者攻讀博士期間發(fā)表論文情況158

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 李秀麗;高智謀;;核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)致病分子機理研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2013年02期

2 吳純?nèi)?劉后利;油菜菌核病致病機理的研究 Ⅳ.病菌侵入途徑和附著胞結(jié)構(gòu)的觀察[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;1990年01期

3 郭安源;朱其慧;陳新;羅靜初;;GSDS:基因結(jié)構(gòu)顯示系統(tǒng)[J];遺傳;2007年08期

4 吳純?nèi)?劉后利;油菜菌核病菌致病機理的研究 Ⅱ.病菌侵染過程的組織病理學(xué)[J];中國油料;1990年01期

5 楊謙;核盤菌侵入油菜超微結(jié)構(gòu)及侵染機制的研究[J];植物病理學(xué)報;1994年03期

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本文編號：867719