本文關鍵詞：中華絨螯蟹螺原體磷脂代謝和精氨酸代謝中幾種關鍵蛋白的功能研究

  更多相關文章： 中華絨螯蟹螺原體 溶血磷脂酶 精氨酸 精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng) 鯡精胺脫亞胺酶系統(tǒng)

【摘要】：中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)是我國重要的淡水養(yǎng)殖種類,近年來,隨著其養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和集約化程度的不斷提高,由細菌、病毒和寄生蟲等病原引起的各種病害日益嚴重,給中華絨螯蟹養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的損失。其中顫抖病是中華絨螯蟹中最為嚴重的病害,王文等的前期研究證明顫抖病的病原為一種特殊的細菌——螺原體,并正式命名為中華絨螯蟹螺原體(Spiroplasma eriocheiris)。S. eriocheiris不僅可以感染其自然界宿主中華絨螯蟹,還可以感染雞胚和新生小鼠,引起小鼠白內障的病癥,這與非凡螺原體(Spiroplasma mirum)可以引起嚙齒類新生個體(包括新生小鼠)患白內障的病癥非常相似。前期研究對S. eriocheiris生理生化性質、分類地位、病原檢測、敏感藥物的篩選和有效治療藥物的藥代動力學進行了研究,以及分別構建了中華絨螯蟹螺原體侵染脊椎動物小鼠胚胎成纖維細胞(3T6細胞)模型和侵染無脊椎動物中華絨螯蟹血細胞模型。但是有關其分子生物學和主要蛋白功能方面的研究還處于前期階段。因此,本博士學位論文在前期中華絨螯蟹螺原體基因組測序的基礎上,利用比較基因組學,篩選和鑒定與中華絨螯蟹螺原體與致病相關的毒力因子、能量代謝以及侵染機制相關蛋白,這些工作為下一步研究中華絨螯蟹螺原體分子水平致病機制打下了堅實的基礎。1.中華絨螯蟹螺原體溶血磷脂酶SE-LsyoPL基因的生物信息學分析及其克隆、表達純化以及酶活性質的分析通過對中華絨螯蟹螺原體基因組進行比對,發(fā)現中華絨螯蟹螺原體中僅含有一種磷脂酶——溶血磷脂酶(Lysophospholipase)并將之命名為SE-LsyoPLA,該序列全長927bp,編碼一個308個氨基酸的蛋白,預測的蛋白分子量和等電點分別是35 kDa和pI 9.64。生物信息學分析,其氨基酸序列含有典型的GXSXG序列,三級結構中Ser-Asp-His三個氨基酸組成了催化三聯體。對SE-LsyoPL基因進行成功克隆,點突變,進行原核表達,蛋白純化。通過水解對硝基酚酯類p-NP palmitate實驗分析重組蛋白的酶活性,結果顯示SE-LsyoPL的最適的pH值為7.0左右,最適溫度為30℃；在不同溫度下的熱穩(wěn)定性分析結果表明,在0-30℃溫度范圍內酶活力較為穩(wěn)定,當溫度升高至50℃時,SE-LsyoPL已基本失活,說明SE-LsyoPL是一種溫和的、中性的磷脂酶。考察不同金屬離子對SE-LsyoPL酶活力的影響,Ca2+和Mn2+對酶的活性沒有影響。本實驗中還發(fā)現SE-LsyoPL對于長鏈脂肪酸的水解能力強,但是對于短鏈脂肪酸的水解能力弱。2.中華絨螯蟹螺原體溶血磷脂酶(SE-LsyoPL)功能分析利用已經純化的SE-LsyoPL的重組蛋白成功地制備了SE-LsyoPL的多克隆抗體,采用間接ELISA法檢測抗血清的效價,SE-LsyoPL抗血清的效價在1：70000左右。實驗中利用超高速離心的方法成功的提取了S. eriocheiris膜蛋白,利用Western blotting分析表明,SE-LsyoPL是螺原體的一種膜蛋白。實驗中采用已經成熟的S. eriocheiri體外侵染小鼠胚胎成纖維細胞(3T6細胞)的模型進行細胞學實驗,采用抗體中和實驗封閉S. eriocheiri表面的SE-LsyoPL酶位點來觀察螺原體侵染能力的變化。土霉素法檢測表明,當SE-LsyoPL抗體濃度為20 μg/ml時,螺原體在前期對3T6細胞的侵染率明顯下降,螺原體侵染至48h后抗體中和實驗組與螺原體侵染組中螺原體的侵染率沒有顯著差異(P0.05)；當SE-LsyoPL抗體濃度為2 μg/ml時,螺原體的侵染率并沒有顯著變化。采用流式細胞技術,進一步分析抗體中和實驗組(SE-LsyoPL抗體濃度為20 μg/mL)和螺原體侵染組中細胞凋亡情況。螺原體侵染48h后,中和實驗組中的早期細胞凋亡率要明顯低于螺原體侵染組(P0.05),正常細胞的數量也明顯的高于螺原體侵染組(P0.05),并且中和實驗組中細胞形態(tài)較好。采用間接免疫熒光電鏡技術,觀察螺原體對3T6細胞的侵染情況,結果表明在接種螺原體48h后抗體中和實驗組中螺原體的分布主要成零星的點狀分布,主要在宿主細胞的胞膜上分布且綠色熒光微弱。而在螺原體侵染組中可以看到大量螺原體侵染到宿主細胞內部并成團狀分布,形成包涵體且熒光強度高,表明螺原體的侵染要明顯的高于中和實驗組。研究表明,當螺原體表面的SE-LsyoPL酶位點被抗體封閉時,螺原體的侵染率明顯下降。3.中華絨螯蟹螺原體的生長特性以及對精氨酸利用的研究本實驗中首先利用了一種簡單的培養(yǎng)基R8-1對S. eriocheiris生長特性進行研究,研究表明螺原體能很好生長于R8-1培養(yǎng)基中,S. eriocheiris的最適生長溫度為30-32℃,最高生長溫度約42℃。S. eriocheiris最適pH為7.2-7.6,最低耐受約pH約5.0,最高耐受pH高達10.0。培養(yǎng)基中添加20 mM/L精氨酸時,發(fā)現螺原體的生長速度要明顯高于沒有添加精氨酸的培養(yǎng)基中的生長速度,繼續(xù)培養(yǎng)時,添加精氨酸組的平臺期的要明顯變長。高效液相色譜(HPLC)對螺原體利用精氨酸的情況進行分析,在培養(yǎng)的前期螺原體并不能利用精氨酸,而到了平臺期以后螺原體才能逐漸的開始利用精氨酸,并且此時培養(yǎng)基中瓜氨酸和鳥氨酸兩種氨基酸呈明顯上升趨勢,說明此時螺原體能夠很好的利用精氨酸作為能源物質。4.中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶(Arginine dei mi nase, ADI)系統(tǒng)中關鍵基因的生物信息學分析及其克隆、表達純化和功能分析通過基因組學研究表明,S. eriocheiris基因組中含有一條典型的精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase, ADI)系統(tǒng),并包含完整的基因簇,通過生物信息學分析表明ADI系統(tǒng)含有精氨酸脫亞胺酶(ADI),鳥氨酸氨甲酰轉移酶(OTC),精氨酸鳥氨酸轉運基因(AOA)和氨甲酰激酶(CK)四個酶。首先對ADI系統(tǒng)中三種關鍵的蛋白——精氨酸脫亞胺酶(ADI)、鳥氨酸氨甲酰轉移酶(OTC)和氨甲酰激酶(CK)進行基因進行克隆、點突變、重組蛋白原核表達、蛋白純化以及多克隆抗體的制備。通過Western blotting分析發(fā)現CK和OTC兩種酶是在S. eriocheiris的細胞膜上具有分布。在不同pH、不同溫度、培養(yǎng)基中添加精氨酸和不同濃度葡萄糖的條件下,利用RealTime-PCR和Western blotting技術,從分子層面上研究S. eriocheiris在不同環(huán)境條件下ADI系統(tǒng)關鍵酶的基因水平和蛋白水平表達量變化情況,結果表明ADI系統(tǒng)在高溫和酸性(pH=5)等不良的環(huán)境下,ADI系統(tǒng)中基因的表達量明顯上調,蛋白的表達量顯著升高。但在培養(yǎng)基中高濃度糖類時,ADI系統(tǒng)卻會被明顯的抑制。綜合結果表明精氨酸代謝系統(tǒng)在S. eriocheiris能量代謝和抗逆過程中起到重要的作用。5.中華絨螯蟹螺原體鯡精胺脫亞胺酶(Agmatine deiminase, AgDI)系統(tǒng)中關鍵基因的生物信息學分析及其克隆、表達純化和功能的分析研究發(fā)現S. eriocheiris基因組中還含有一條完整的鯡精胺脫亞胺(Agmatine deiminase, AgDI)系統(tǒng),基因簇中含有完整的基因包括鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)、胍丁胺-腐胺轉運蛋白(A/P)和腐胺氨甲酰轉移酶(PTC)。首先對AgDI系統(tǒng)中兩種關鍵的蛋白鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰轉移酶(PTC)進行基因克隆、點突變、重組蛋白原核表達、蛋白純化以及多克隆抗體的制備。利用RealTime-PCR和Western blotting方法從分子層面上研究S. eriocheiris在不同環(huán)境條件下(不同pH環(huán)境、不同溫度及不同濃度葡萄糖條件下)AgDI系統(tǒng)關鍵酶的基因水平和蛋白水平表達量變化,結果表明AgDI系統(tǒng)在酸性(pH=5)不良的環(huán)境下,AgDI系統(tǒng)中基因的表達量明顯上調,蛋白的表達量顯著升高,但是在高溫情況下,AgDI酶的表達量并沒有明顯升高,表明AgDI系統(tǒng)在高溫下沒有被明顯的激活。在當培養(yǎng)基中高濃度糖類存在的條件下,AgDI系統(tǒng)卻會被明顯的抑制。結果表明鯡精胺脫亞胺酶系統(tǒng)在S. eriocheiris能量代謝和抵抗pH過程中起到重要的作用,但是在高溫條件下沒有明顯的變化。
【關鍵詞】：中華絨螯蟹螺原體 溶血磷脂酶 精氨酸 精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng) 鯡精胺脫亞胺酶系統(tǒng)
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S945
【目錄】：

• 摘要3-7
• Abstract7-17
• 第一章 緒論17-41
• 1.1 螺原體的發(fā)現、分類、生物學特性和致病機理的研究17-23
• 1.1.1 螺原體的發(fā)現與相關報道17-19
• 1.1.2 螺原體的基本生物學特性19-21
• 1.1.3 螺原體的分布及其致病性21-22
• 1.1.4 螺原體致病機制的研究進展22-23
• 1.2 中華絨螯蟹螺原體的研究進展23-26
• 1.2.1 中華絨螯蟹顫抖病的流行病學調查23
• 1.2.2 中華絨螯蟹螺原體的研究進展23-26
• 1.3 柔膜體綱細菌基因組學研究進展26-32
• 1.3.1 螺原體比較基因組學研究28-29
• 1.3.2 螺原體的基本代謝特征29-32
• 1.4 磷脂酶的研究進展32-35
• 1.4.1 磷脂酶的分類32
• 1.4.2 磷脂酶的致病作用機理32
• 1.4.3 溶血磷脂酶32-35
• 1.5 精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,ADI)系統(tǒng)和精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,AgDI)系統(tǒng)的研究進展35-39
• 1.5.1 精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,ADI)系統(tǒng)的生理功能35-37
• 1.5.2 精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,ADI)系統(tǒng)的致病作用37-38
• 1.5.4 鯡精胺脫亞胺酶(Agmatine deiminase,AgDI)系統(tǒng)38-39
• 1.6 本論文的研究目的、內容、意義和技術路線39-41
• 第二章 中華絨螯蟹螺原體溶血磷脂酶SE-LsyoPL基因的生物信息學分析及其克隆、表達純化以及酶活性質的分析41-62
• 2.1 材料41-45
• 2.1.1 主要設備41-42
• 2.1.2 主要試劑42-44
• 2.1.3 引物設計與合成44-45
• 2.2 方法45-69
• 2.2.1 序列分析45-115
• 2.2.2 中華絨螯蟹螺原體基因組DNA的提取115-45
• 2.2.3 SE-LsyoPL基因PCR擴增45-46
• 2.2.4 SE-LsyoPL基因與pUC載體的連接46
• 2.2.5 pUC-SE-LsyoPL連接產物的轉化46
• 2.2.6 菌液PCR鑒定陽性克隆、測序分析46
• 2.2.7 點突變實驗46-48
• 2.2.8 構建表達載體48
• 2.2.9 表達重組蛋白及鑒定48-95
• 2.2.10 Western blot分析蛋白表達結果確定目的蛋白誘導表達成功95-49
• 2.2.11 Ni-NTA Agarose親和層析49-50
• 2.2.12 中華絨螯蟹溶血磷脂酶(SE-LsyoPL)的活力測定和蛋白含量測定50
• 2.2.13 酶學性質的測定50-51
• 2.2.14 重組酶的底物特異性51-69
• 2.3 結果69-59
• 2.3.1 中華絨螯蟹螺原體基因組DNA的提取、SE-LsyoPL基因PCR擴增及序列分析115-55
• 2.3.2 中華絨螯蟹螺原體SE-LsyoPL基因的點突變55
• 2.3.3 原核表達載體的構建55-56
• 2.3.4 重組蛋白的表達、純化與鑒定56
• 2.3.5 重組中華絨螯蟹磷脂酶(SE-LsyoPL)的酶學性質56-58
• 2.3.6 重組中華絨螯蟹磷脂酶(SE-LsyoPL)的底物特異性58-59
• 2.4 討論59-62
• 第三章 中華絨螯蟹螺原體溶血磷脂酶(SE-LsyoPL)功能分析62-79
• 3.1 主要實驗材料、儀器與試劑62-64
• 3.1.1 實驗材料62-63
• 3.1.2 主要儀器和耗材63
• 3.1.3 主要試劑配方63-64
• 3.2 實驗方法64-69
• 3.2.1 制備多克隆抗體與其效價檢測64-65
• 3.2.2 Western blotting分析65
• 3.2.3 中華絨螯蟹螺原體總蛋白和膜蛋白的提取65-66
• 3.2.4 3T6細胞細胞培養(yǎng)與侵染66-67
• 3.2.5 SE-LsyoPL抗體中和實驗67
• 3.2.6 間接免疫熒光法標記定位67-68
• 3.2.7 土霉素法檢測侵染率68
• 3.2.8 利用流式細胞技術檢測螺原體感染后3T6細胞的細胞凋亡68-69
• 3.3 結果69-76
• 3.3.1 SE-LsyoPL重組蛋白多克隆抗體制備與效價檢測69-70
• 3.3.2 螺原體總蛋白、膜蛋白和細胞質蛋白SDS-PAGE及Western blotting分析70-72
• 3.3.3 土霉素法檢測中華絨螯蟹螺原體S.eriocheiris侵染比例以及中和實驗侵染結果72-73
• 3.3.4 3T6細胞細胞培養(yǎng)與侵染結果73-75
• 3.3.5 間接免疫熒光法標記定位結果75-76
• 3.4 討論76-79
• 第四章 中華絨螯蟹螺原體生長特性及對精氨酸利用的研究79-92
• 4.1 主要實驗材料、儀器與試劑79-80
• 4.1.1 實驗材料79
• 4.1.2 主要儀器和耗材79-80
• 4.1.3 主要試劑配方80
• 4.2 實驗方法80-83
• 4.2.1 高效液相色譜法測定中華絨螯蟹螺原體對精氨酸的利用情況80-81
• 4.2.2 中華絨螯蟹螺原體計數--顏色改變單位法(colour change unit,簡稱CCU)81-82
• 4.2.3 中華絨螯蟹螺原體生長曲線測定82
• 4.2.4 溫度對中華絨螯蟹螺原體生長的影響82
• 4.2.5 pH對中華絨螯蟹螺原體生長的影響82
• 4.2.6 培養(yǎng)基中添加精氨酸對對中華絨螯蟹螺原體生長的影響82-83
• 4.3 結果83-90
• 4.3.1 R8-1培養(yǎng)基中溫度對中華絨螯蟹螺原體生長的影響83
• 4.3.2 pH對中華絨螯蟹螺原體生長的影響83-84
• 4.3.3 R8-1培養(yǎng)基中添加精氨酸對中華絨螯蟹螺原體生長的影響84-85
• 4.3.4 高效液相色譜法測定中華絨螯蟹螺原體對精氨酸的利用情況85-90
• 4.4 討論90-92
• 第五章 中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,ADI)系統(tǒng)中關鍵基因的生物信息學分析及其克隆、表達純化和功能的分析92-114
• 5.1 材料93
• 5.1.1 實驗儀器93
• 5.1.2 實驗試劑93
• 5.2 實驗方法93-98
• 5.2.1 序列分析93
• 5.2.2 中華絨螯蟹螺原體基因組DNA的提取93
• 5.2.3 螺原體培養(yǎng)93-94
• 5.2.4 精氨酸脫亞胺酶中關鍵基因——精氨酸脫亞胺酶(ADI),鳥氨酸氨甲酰轉移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)的PCR擴增94-95
• 5.2.5 精氨酸脫亞胺酶(ADI),鳥氨酸氨甲酰轉移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)基因與pUC19載體的連接95
• 5.2.6 pUC-ADI,OTC和CK連接產物的轉化95
• 5.2.7 菌液PCR鑒定陽性克隆、測序分析95
• 5.2.8 點突變實驗95
• 5.2.9 表達載體的構建95
• 5.2.10 重組蛋白的表達與鑒定95
• 5.2.11 Western blot分析蛋白表達結果確定目的蛋白誘導表達成功95
• 5.2.12 Ni-NTA Agarose親和層析95
• 5.2.13 多克隆抗體的制備與效價檢測95
• 5.2.14 中華絨螯蟹螺原體螺原體總蛋白和膜蛋白的提取95
• 5.2.15 RNA提取95-96
• 5.2.16 去除DNA96-97
• 5.2.17 反轉錄97
• 5.2.18 Real Time PCR反應97-98
• 5.3 實驗結果98-111
• 5.3.1 中華絨螯蟹螺原體基因組DNA的提取,精氨酸脫亞胺酶(ADI),鳥氨酸氨甲酰轉移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)基因PCR擴增及序列分析98-102
• 5.3.2 中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)中基因的點突變102
• 5.3.3 原核表達載體的構建102
• 5.3.4 重組蛋白的表達、純化與鑒定102-103
• 5.3.5 精氨酸脫亞胺酶(ADI),鳥氨酸氨甲酰轉移酶(OTC),氨甲酰激酶(CK)重組蛋白多克隆抗體制備與效價檢測及Western blotting分析103-105
• 5.3.6 中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)中基因Real time RTPCR分析105-110
• 5.3.7 中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)中關鍵酶在不同條件下蛋白表達量的分析110-111
• 5.4 討論111-114
• 第六章 中華絨螯蟹螺原體鯡精胺脫亞胺酶(Agmatine deiminase,AgDI)系統(tǒng)中關鍵基因的生物信息學分析及其克隆、表達純化和功能的分析114-128
• 6.1 材料115
• 6.1.1 實驗儀器93-115
• 6.1.2 實驗試劑115
• 6.2 實驗方法115-117
• 6.2.1 序列分析115
• 6.2.2 中華絨螯蟹螺原體基因組DNA的提取115
• 6.2.3 螺原體培養(yǎng)115
• 6.2.4 鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)通路中關鍵基因——鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰轉移酶(PTC)的PCR擴增115-116
• 6.2.5 鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰轉移酶(PTC)與pUC19載體的連接116
• 6.2.6 pUC-AgDI和PTC連接產物的轉化116
• 6.2.7 菌液PCR鑒定陽性克隆、測序分析116
• 6.2.8 點突變實驗116
• 6.2.9 表達載體的構建116
• 6.2.10 重組蛋白的表達與鑒定116
• 6.2.11 Western blot分析蛋白表達結果確定目的蛋白誘導表達成功116-117
• 6.2.12 Ni-NTA Agarose親和層析117
• 6.2.13 多克隆抗體的制備與效價檢測117
• 6.2.14 RNA提取117
• 6.2.15 去除DNA117
• 6.2.16 測量RNA濃度117
• 6.2.17 反轉錄117
• 6.2.18 Real Time PCR反應117
• 6.3 實驗結果117-126
• 6.3.1 中華絨螯蟹螺原體基因組DNA的提取,鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰轉移酶(PTC)基因PCR擴增及序列分析117-120
• 6.3.2 中華絨螯蟹螺原體AgDI系統(tǒng)中基因的點突變120
• 6.3.3 原核表達載體的構建120
• 6.3.4 重組蛋白的表達、純化與鑒定120-121
• 6.3.5 鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)和腐胺氨甲酰轉移酶(PTC)重組蛋白多克隆抗體制備與效價檢測121-122
• 6.3.6 中華絨螯蟹螺原體鯡精胺脫亞胺酶(AgDI)系統(tǒng)中基因Real timeRT-PCR分析122-125
• 6.3.7 中華絨螯蟹螺原體精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)中關鍵酶在不同條件下蛋白表達量的分析125-126
• 6.4 討論126-128
• 全文總結128-132
• 參考文獻132-146
• 附錄A146-148
• 在讀期間發(fā)表的學術論文及研究成果148-149
• 致謝149-150

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 趙，

本文編號：846402