本文關(guān)鍵詞：南方水稻黑條矮縮病毒基因序列特征及基質(zhì)蛋白與病毒防控藥劑相互作用研究

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【摘要】：南方水稻黑條矮縮病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)第二組一個新成員。南方水稻黑條矮縮病毒引起的新水稻矮縮病近年在越南北部和我國南方各省爆發(fā),給我國水稻生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失。尋找用于防控SRBSDV藥劑篩選的候選靶標(biāo),建立基于SRBSDV靶標(biāo)蛋白的SRBSDV防控藥劑篩選模型,篩選出具有更高活性的抗SRBSDV小分子化合物可為防治SRBSDV提供新的技術(shù)措施。本研究首先采用熒光定量PCR方法,對南方水稻黑條矮縮病毒的13個基因在水稻寄主中的豐度趨勢進(jìn)行考察,了解SRBSDV的基因組組成。選取表達(dá)量較高的S9、S8以及S10三個基因?yàn)楹蜻x靶標(biāo),利用生物信息學(xué)研究了不同分離物基因組序列性質(zhì),最終確定豐度最高且保守性最強(qiáng)的SRBSDV-P9-1基質(zhì)蛋白為研究靶標(biāo)。結(jié)合生物信息學(xué)分析P9-1蛋白的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)了其氮端保守區(qū)、碳端保守區(qū)和131~160 aa的高變區(qū)。繼而純化獲得了野生型(WT-His-P9-1)、碳端截短23個氨基酸(TR-ΔC23-His-P9-1),氮端截短6個氨基酸(TR-ΔN6-His-P9-1)以及138位定點(diǎn)突變型(MU-138-His-P9-1)的SRBSDV-P9-1靶標(biāo)蛋白。采用熒光滴定光譜法(fluorescence titration,FT)和微量熱泳動技術(shù)(microscale thermophoresis,MST),在離體條件下探究了毒氟磷(dufulin,DFL)與四種蛋白的相互作用,發(fā)現(xiàn)DFL與P9-1的結(jié)合常數(shù)為微摩爾級。同時,進(jìn)行DFL抑制SRBSDV的作用機(jī)制研究,即通過與SRBSDV-P9-1的碳端23個氨基酸結(jié)合,抑制病毒基質(zhì)的形成。建立了基于SRBSDV-P9-1靶標(biāo)蛋白來篩選新型病毒防控藥劑的作用模型。最后,基于建立的SRBSDV-P9-1靶標(biāo)蛋白作用模型,進(jìn)行DFL系列衍生物與蛋白的相互作用研究,篩選出結(jié)合作用更強(qiáng)的小分子化合物。具體結(jié)論如下:(1)SRBSDV基因在水稻體內(nèi)表達(dá)量分析選取不同生長期、不同地區(qū)、不同品種及感染病毒狀況的SRBSDV水稻作為研究對象,采用熒光定量PCR法,對SRBSDV的13個基因片段的表達(dá)量進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明:S9-1、S7-1基因呈現(xiàn)高表達(dá)量特性及S6基因呈現(xiàn)最低表達(dá)量特性,均不受寄主生長期、地域、品種及病毒侵染狀態(tài)的影響;S8、S2基因呈現(xiàn)稍高的表達(dá)量;而其他基因片段如,S1、S3、S4、S5-1、S5-2、S7-2、S9-2及S10則呈現(xiàn)不規(guī)律的表達(dá)趨勢。(2)SRBSDV重要功能基因的生物信息學(xué)分析利用分子生物學(xué)技術(shù),結(jié)合生物信息學(xué)分析基因組核苷酸及氨基酸序列特征,明確不同分離物核苷酸序列的分類地位。對病毒基質(zhì)蛋白P9-1、外殼蛋白P10和核心蛋白P8進(jìn)行理化性質(zhì)和功能預(yù)測等分析,確認(rèn)各基因組的核苷酸全長、GC含量、親水區(qū)及疏水區(qū)、編碼蛋白的信號肽、二級及三級結(jié)構(gòu)等特征;利用Motif、Blast比對,對S8、S9、S10序列進(jìn)行同源性分析;結(jié)合SNP對S8、S9、S10的核苷酸序列進(jìn)行突變分析,并結(jié)合建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹,進(jìn)一步探索病毒的遺傳進(jìn)化趨勢。(3)SRBSDV-P9-1基質(zhì)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及高變結(jié)構(gòu)域分析選擇S9基因組為研究對象,利用Gene Doc軟件分析SRBSDV及水稻黑條矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus,RBSDV)P9-1序列的保守結(jié)構(gòu)域及高變結(jié)構(gòu)域,研究表明:SRBSDV-P9-1與RBSDV-P9-1序列的碳端和氮端具有高度的保守性;同時SRBSDV-P9-1與RBSDV-P9-1序列之間存在一個高變區(qū),即131~160 aa。(4)野生型和突變型SRBSDV-P9-1基質(zhì)蛋白的表達(dá)與純化基于SRBSDV-P9-1生物信息學(xué)研究結(jié)果,利用E.coli BL21(DE3)RIL表達(dá)菌株,成功表達(dá)和純化了野生型(WT-His-P9-1)及三種突變型基質(zhì)蛋白(TR-ΔC23-His-P9-1、TR-ΔN6-His-P9-1以及MU-138-His-P9-1)。(5)DFL及寧南霉素(ningnanmycin,NNM)與P9-1基質(zhì)蛋白相互作用研究利用FT和MST技術(shù)研究了小分子化合物DFL、NNM與P9-1基質(zhì)蛋白的相互作用。研究結(jié)果表明:DFL與WT-His-P9-1的結(jié)合力為1×105.061 M-1(FT)、3.26+/-0.46μM(MST),NNM與WT-His-P9-1的結(jié)合力為1×104.244 M-1(FT)、48.40+/-6.04μM(MST),即DFL與P9-1基質(zhì)蛋白的結(jié)合力明顯強(qiáng)于NNM。為了探究DFL與P9-1的結(jié)合位點(diǎn),利用FT和MST技術(shù)研究了DFL與TR-ΔC23-His-P9-1、TR-ΔN6-His-P9-1和MU-138-His-P9-1三種突變蛋白之間的結(jié)合作用力。研究結(jié)果表明:碳端23個氨基酸對于DFL與基質(zhì)蛋白的結(jié)合起到關(guān)鍵作用。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了基于WT-His-P9-1、TR-ΔC23-His-P9-1蛋白的防控SRBSDV活性小分子化合物作用模型。(6)基于SRBSDV-P9-1基質(zhì)蛋白靶標(biāo)模型的DFL衍生物的篩選基于構(gòu)建的靶標(biāo)蛋白作用模型,采用FT和MST技術(shù)手段,考察了DFL衍生物與WT-His-P9-1基質(zhì)蛋白的結(jié)合作用力。研究結(jié)果表明,芳雜環(huán)噻吩取代的化合物及苯環(huán)上沒有取代基、苯環(huán)引入-F、-Cl、-NO2、-CF3等六個DFL衍生物與WT-His-P9-1靶標(biāo)蛋白的結(jié)合均為強(qiáng)結(jié)合,且都具有微摩爾級的結(jié)合能力;碳端23個氨基酸依然影響了小分子化合物與P9-1基質(zhì)蛋白的結(jié)合。
【關(guān)鍵詞】：南方水稻黑條矮縮病毒 基因豐度分析 生物信息學(xué)分析 毒氟磷 P9-1非結(jié)構(gòu)蛋白
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S435.111.4
【目錄】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 縮略詞列表12-14
• 前言14-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述16-24
• 1.1 南方水稻黑條矮縮病毒粒子結(jié)構(gòu)及蛋白功能研究16-20
• 1.1.1 南方水稻黑條矮縮病毒P6的沉默抑制子功能17-18
• 1.1.2 南方水稻黑條矮縮病毒P7的管狀結(jié)構(gòu)18
• 1.1.3 南方水稻黑條矮縮病毒P9-1 病毒基質(zhì)組分18-19
• 1.1.4 南方水稻黑條矮縮病毒蛋白互作研究19-20
• 1.2 南方水稻黑條矮縮病毒的生物信息學(xué)研究20-22
• 1.3 南方水稻黑條矮縮病毒防控藥劑的化學(xué)生物學(xué)研究22-24
• 第二章 研究總體思路24-26
• 2.1 研究目的意義24
• 2.2 研究方案及技術(shù)路線24-25
• 2.3 研究內(nèi)容25-26
• 第三章 SRBSDV基因在水稻體內(nèi)表達(dá)量分析26-57
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料26-32
• 3.1.1 供試水稻26-28
• 3.1.2 引物設(shè)計28-29
• 3.1.3 主要試劑及配制29-30
• 3.1.4 主要的儀器和設(shè)備30-32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟32-36
• 3.2.1 疑似水稻樣本的檢測32-35
• 3.2.2 RT-q PCR方法分析SRBSDV各基因在水稻中表達(dá)模式35-36
• 3.3 結(jié)果與討論36-56
• 3.3.1 Dot-ELISA檢測SRBSDV陽性水稻樣本36-37
• 3.3.2 疑似感染SRBSDV水稻總RNA完整性分析37
• 3.3.3 疑似感染SRBSDV水稻病株的PCR檢測37-38
• 3.3.4 SRBSDV的RT-q PCR引物驗(yàn)證38-39
• 3.3.5 不同生長期水稻組織中SRBSDV表達(dá)模式39-43
• 3.3.6 不同地區(qū)來源水稻組織中SRBSDV表達(dá)模式43-49
• 3.3.7 不同品種水稻組織中SRBSDV表達(dá)模式49-56
• 3.4 小結(jié)56-57
• 第四章 重要SRBSDV基因的生物信息學(xué)分析57-110
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料57-59
• 4.1.1 供試水稻57
• 4.1.2 菌株及載體57-58
• 4.1.3 主要試劑58
• 4.1.4 主要的儀器和設(shè)備58-59
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟59-63
• 4.2.1 疑似水稻樣本的檢測59
• 4.2.2 SRBSDV基因組的克隆和測序59-62
• 4.2.3 序列比對和提交62
• 4.2.4 生物信息學(xué)分析方法62-63
• 4.3 結(jié)果與討論63-107
• 4.3.1 SRBSDV-S8、S9、S10序列及編碼蛋白表征63-86
• 4.3.2 SRBSDV-S8、S9、S10遺傳變異研究86-107
• 4.4 小結(jié)107-110
• 第五章 SRBSDV-P9-1 基質(zhì)蛋白與病毒防控藥劑相互作用研究110-148
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料110-114
• 5.1.1 供試水稻110
• 5.1.2 病毒防控藥劑110-111
• 5.1.3 供試SRBSDV-P9-1 基質(zhì)蛋白111
• 5.1.4 試劑及緩沖液配制111-114
• 5.1.5 主要儀器設(shè)備114
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟114-126
• 5.2.1 SRBSDV-P9-1 序列比對分析114-115
• 5.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建115-120
• 5.2.3 SRBSDV-P9-1 基質(zhì)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)純化120-126
• 5.3 結(jié)果與討論126-145
• 5.3.1 SRBSDV-P9-1 序列比對分析126-131
• 5.3.2 P9-1 重組載體的構(gòu)建及鑒定131-134
• 5.3.3 P9-1 蛋白的表達(dá)小試134-136
• 5.3.4 P9-1 蛋白的純化136-137
• 5.3.5 P9-1 與六種病毒防控藥劑的相互作用137-138
• 5.3.6 P9-1 與DFL及NNM的相互作用138-145
• 5.4 小結(jié)145-148
• 5.4.1 Gene Doc多重序列比對SRBSDV-P9-1145-146
• 5.4.2 蛋白的表達(dá)純化146
• 5.4.3 WT-His-P9-1 與DFL和NNM的相互作用146
• 5.4.4 P9-1 突變蛋白與DFL的相互作用146-148
• 第六章 基于SRBSDV-P9-1 基質(zhì)蛋白靶標(biāo)模型的DFL衍生物的篩選148-162
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料148-149
• 6.1.1 DFL衍生物148-149
• 6.1.2 供試SRBSDV-P9-1 基質(zhì)蛋白149
• 6.1.3 試劑及緩沖液配制149
• 6.1.4 主要儀器設(shè)備149
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法和步驟149-150
• 6.2.1 SRBSDV-P9-1 基質(zhì)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)純化149
• 6.2.2 熒光光譜的測定149-150
• 6.2.3 MST測定150
• 6.3 結(jié)果與討論150-160
• 6.3.1 六個DFL衍生物對WT-His-P9-1 的熒光光譜研究150-154
• 6.3.2 六個DFL衍生物對TR-ΔC23-His-P9-1 的熒光光譜研究154-158
• 6.3.3 部分DFL衍生物對WT-His-P9-1 的MST研究158-159
• 6.3.4 部分DFL衍生物對TR-ΔC23-His-P9-1 的MST研究159-160
• 6.4 小結(jié)160-162
• 第七章 結(jié)論162-168
• 7.1 研究結(jié)果162-166
• 7.1.1 SRBSDV基因在水稻體內(nèi)表達(dá)豐度分析162
• 7.1.2 SRBSDV重要功能基因的生物信息學(xué)分析162-164
• 7.1.3 SRBSDV-P9-1 基質(zhì)蛋白與抗病毒活性化合物相互作用研究164-165
• 7.1.4 基于SRBSDV-P9-1 基質(zhì)蛋白靶標(biāo)模型的DFL衍生物的篩選165-166
• 7.2 創(chuàng)新點(diǎn)166-167
• 7.3 未來工作展望167-168
• 參考文獻(xiàn)168-177
• 致謝177-178
• 附錄178-183
• F-1 攻讀博士期間發(fā)表的論文及申請專利178-182
• F-2 攻讀博士期間獲得的獎勵182-183

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本文編號：814680