發(fā)布時(shí)間：2017-09-01 20:31

  本文關(guān)鍵詞：草魚(yú)感染嗜水氣單胞菌miRNA篩選及其功能分析

  更多相關(guān)文章： 草魚(yú) 細(xì)菌性敗血癥 Toll樣受體信號(hào)通路 mi RNA

【摘要】：草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)產(chǎn)量及產(chǎn)值在最近幾年一直位居我國(guó)和世界養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)前列。人工養(yǎng)殖條件下的草魚(yú)病害較多,提高草魚(yú)抗病力是增加養(yǎng)殖產(chǎn)量的重要途徑之一。草魚(yú)抗病性能差異與遺傳有關(guān)。從轉(zhuǎn)錄組水平探索草魚(yú)易感和抗病群體間的差異表達(dá)基因,對(duì)于解析不同群體間的差異及揭示形成該差異的分子機(jī)理具有重要作用。本論文通過(guò)嗜水氣單胞菌人工感染草魚(yú),分別構(gòu)建草魚(yú)易感和抗病群體。利用高通量測(cè)序技術(shù)分析草魚(yú)易感和抗病群體腎臟脾臟中的差異表達(dá)mi RNA和m RNA。篩選其中的關(guān)鍵mi RNA和m RNA,對(duì)其調(diào)控關(guān)系和功能進(jìn)行分析鑒定。主要研究結(jié)果如下:1.草魚(yú)易感和抗病群體轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析利用Hiseq 2000技術(shù)平臺(tái)對(duì)草魚(yú)易感和抗病群體腎臟脾臟文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序,在易感和抗病群體文庫(kù)分別獲得了7.09 G和6.13 G數(shù)據(jù)量。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、拼接和組裝后共獲得199,554個(gè)轉(zhuǎn)錄本,其中28,311個(gè)轉(zhuǎn)錄本注釋為己知功能蛋白。在草魚(yú)易感和抗病群體中共有721個(gè)顯著差異表達(dá)的基因。相對(duì)于易感群體,在抗病群體中有475個(gè)差異基因?yàn)樯险{(diào)表達(dá),246個(gè)為下調(diào)表達(dá)。生物學(xué)功能和信號(hào)通路富集分析表明,差異表達(dá)基因主要富集到免疫相關(guān)信號(hào)通路。2.草魚(yú)易感和抗病群體脾臟關(guān)鍵mi RNA篩選鑒定利用Hiseq 2000技術(shù)平臺(tái)對(duì)草魚(yú)脾臟易感與抗病群體2個(gè)small RNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序和表達(dá)模式分析。通過(guò)比對(duì)mi Rbase 19.0數(shù)據(jù)庫(kù),獲得61個(gè)已知mi RNA,預(yù)測(cè)得到124個(gè)新mi RNA。分析這185個(gè)mi RNA表達(dá)情況,表明mi R-451在易感群體中表達(dá)量最高,mi R-101a在抗病群體中表達(dá)量最高,cid-mi Rn-85在兩個(gè)群體中的差異倍數(shù)最大(4.12倍)。在草魚(yú)易感和抗病群體中,共發(fā)現(xiàn)21個(gè)mi RNA表達(dá)情況具有顯著差異,其中5個(gè)mi RNA在易感群體顯著高表達(dá),16個(gè)在抗病群體顯著高表達(dá)。21個(gè)差異表達(dá)mi RNA共預(yù)測(cè)得到287個(gè)靶基因,對(duì)這些靶基因的功能進(jìn)行富集發(fā)現(xiàn)其中有35條通路與免疫功能相關(guān)。對(duì)草魚(yú)易感群體中高表達(dá)的5個(gè)mi RNA進(jìn)行后續(xù)分析。草魚(yú)組織表達(dá)模式分析表明,lei-7i和cid-mi Rn-118在免疫相關(guān)組織腎臟和脾臟高表達(dá),cid-mi Rn-3和mi R-451在血液中高表達(dá)。細(xì)菌感染草魚(yú)過(guò)程中,let-7i、cid-mi Rn-118、cid-mi Rn-3和mi R-451均呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)表達(dá)模式。使用mi Randa軟件預(yù)測(cè)lei-7i和cid-mi Rn-118在草魚(yú)中的潛在靶基因。利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和過(guò)表達(dá)試驗(yàn),驗(yàn)證lei-7i和cid-mi Rn-118通過(guò)靶向Citlr4和Cinfil3-6基因3‘非編碼區(qū)抑制Citlr4和Cinfil3-6基因表達(dá)。組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),草魚(yú)Citlr4基因在脾臟和腎臟中顯著高表達(dá)。細(xì)菌和病毒均可影響Citlr4的表達(dá)水平。過(guò)表達(dá)草魚(yú)Citlr4基因可以激活下游免疫相關(guān)基因il-1β,il-8和TNF-α。3.草魚(yú)易感和抗病群體腎臟關(guān)鍵mi RNA篩選鑒定利用Hiseq 2000技術(shù)平臺(tái)對(duì)草魚(yú)腎臟易感和抗病群體2個(gè)small RNA文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序和表達(dá)模式分析。通過(guò)比對(duì)mi Rbase 19.0數(shù)據(jù)庫(kù),獲得97個(gè)已知mi RNA,預(yù)測(cè)到95個(gè)新mi RNA。分析這192個(gè)mi RNA的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)mi R-101a在易感和抗病群體中的表達(dá)量均為最高,cid-mi Rn-154在兩個(gè)群體中的差異倍數(shù)最大(5.19倍)。在草魚(yú)易感和抗病群體中,共發(fā)現(xiàn)9個(gè)mi RNA表達(dá)情況具有顯著差異,其中3個(gè)mi RNA在易感群體高表達(dá),6個(gè)在抗病群體高表達(dá)。9個(gè)差異表達(dá)mi RNA共預(yù)測(cè)得到188個(gè)靶基因,對(duì)這些靶基因的功能進(jìn)行富集發(fā)現(xiàn)有26條與免疫功能相關(guān)。對(duì)草魚(yú)易感和抗病群體中9個(gè)差異表達(dá)mi RNA進(jìn)行后續(xù)分析。草魚(yú)組織表達(dá)譜分析表明,他們?cè)?個(gè)免疫相關(guān)組織中均有表達(dá)。使用mi Randa軟件對(duì)靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)mi R-142a-3p、mi R-21、mi R-223、cid-mi Rn-115和cid-mi Rn-131在Citlr5基因的3’UTR區(qū)域均有靶位點(diǎn)。進(jìn)行草魚(yú)組織表達(dá)譜和草魚(yú)腎細(xì)胞受鞭毛蛋白刺激實(shí)驗(yàn)分析,結(jié)果表明mi R142a-3p、cid-mi Rn-115與Citlr5的表達(dá)模式呈負(fù)相關(guān)。草魚(yú)腎細(xì)胞中過(guò)表達(dá)mi R-142a-3p和cid-mi Rn-115,結(jié)果表明Citlr5基因表達(dá)水平被抑制。組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn),Citlr5基因在肝臟和脾臟中顯著高表達(dá)。在草魚(yú)腎細(xì)胞中,細(xì)菌和病毒均可影響Citlr5的表達(dá)水平。在草魚(yú)腎細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)草魚(yú)Citlr5基因可以激活下游免疫相關(guān)基因il-1β、il-8和TNF-α。4.草魚(yú)mi RNA內(nèi)參基因篩選鑒定用2個(gè)常用的內(nèi)參基因18s r RNA、β-actin和草魚(yú)中高表達(dá)的7個(gè)mi RNA作為候選內(nèi)參。使用ge Norm v.3.5、Norm Finder、Best Keeper和comparative deltaCt四種軟件程序,對(duì)9個(gè)候選內(nèi)參在草魚(yú)18個(gè)胚胎發(fā)育階段和12個(gè)組織的穩(wěn)定性進(jìn)行了計(jì)算。在未受精卵至原腸期階段,mi R-126-3p顯示最為穩(wěn)定;在眼囊出現(xiàn)期至孵化后10天,mi R-22a最為穩(wěn)定。確定了不同組織中的穩(wěn)定表達(dá)的mi RNA:在血液和肝臟中最穩(wěn)定的是mi R-126-3p,鰓中是mi R-101a,腎臟中是mi R-192,腸是mi R-451,在腦、頭腎、脾臟、心臟、肌肉、皮膚和鰭條中mi R-22a最為穩(wěn)定。
【關(guān)鍵詞】：草魚(yú) 細(xì)菌性敗血癥 Toll樣受體信號(hào)通路 mi RNA
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S943
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 引言14-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-23
• 1.1 Toll樣受體生物學(xué)功能15-17
• 1.1.1 TLR結(jié)構(gòu)和分布15-16
• 1.1.2 TLR的模式識(shí)別作用16-17
• 1.2 TLR信號(hào)傳遞途徑17-20
• 1.2.1 依賴(lài)MyD88 途徑17
• 1.2.2 非依賴(lài)MyD88 途徑17-18
• 1.2.3 TLR信號(hào)通路下游的炎性因子18-19
• 1.2.4 TLR信號(hào)通路的負(fù)向調(diào)控19-20
• 1.3 魚(yú)類(lèi)toll樣受體的生物學(xué)功能研究20-21
• 1.3.1 魚(yú)類(lèi)TLRs的類(lèi)型和結(jié)構(gòu)特征20-21
• 1.3.2 魚(yú)類(lèi)TLR的配體特異性及其信號(hào)途徑21
• 1.4 Toll樣受體信號(hào)通路與細(xì)菌疾病相關(guān)的研究21-23
• 第二章 草魚(yú)轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜分析23-46
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 草魚(yú)樣品23
• 2.1.2 細(xì)菌及細(xì)胞23-24
• 2.1.3 質(zhì)粒和菌株24
• 2.1.4 主要試劑及耗材24-25
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備25
• 2.2 方法25-29
• 2.2.1 嗜水氣單胞菌感染草魚(yú)半數(shù)致死濃度測(cè)定25-26
• 2.2.2 草魚(yú)易感和抗病群體篩選26
• 2.2.3 總RNA提取26
• 2.2.4 草魚(yú)易感和抗病群體脾臟腎臟轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序26-27
• 2.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR27-29
• 2.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析29
• 2.3 結(jié)果29-45
• 2.3.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)29-30
• 2.3.2 轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果和分析30-32
• 2.3.3 unigene功能注釋和預(yù)測(cè)編碼蛋白框32-34
• 2.3.4 GO功能分類(lèi)和代謝通路分析34-36
• 2.3.5 Unigene表達(dá)差異分析36-39
• 2.3.6 miRNA與mRNA整合分析39-45
• 2.4 討論45-46
• 第三章 草魚(yú)易感和抗病群體脾臟關(guān)鍵miRNA篩選鑒定46-71
• 3.1 材料46
• 3.2 方法46-53
• 3.2.1 嗜水氣單胞菌感染草魚(yú)半數(shù)致死濃度的測(cè)定46-47
• 3.2.2 草魚(yú)易感和抗病群體篩選47
• 3.2.3 總RNA提取47
• 3.2.4 草魚(yú)易感和抗病群體脾臟small RNA高通量測(cè)序47-48
• 3.2.5 載體構(gòu)建48-51
• 3.2.6 草魚(yú)腎細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)51
• 3.2.7 CIK細(xì)胞轉(zhuǎn)染51-52
• 3.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)52
• 3.2.9 過(guò)表達(dá)目的基因?qū)κ人畾鈫伟肭諧IK細(xì)胞的影響52-53
• 3.2.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR53
• 3.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析53
• 3.3 結(jié)果53-66
• 3.3.1 草魚(yú)脾臟易感和抗病small RNA測(cè)序質(zhì)量及長(zhǎng)度分布53-55
• 3.3.2 miRNAs差異表達(dá)分析55-58
• 3.3.3 miRNA靶基因預(yù)測(cè)及富集分析58-60
• 3.3.4 cid-miRn-118 和let-7i靶基因驗(yàn)證60-62
• 3.3.5 Citlr4 在不同組織中的表達(dá)情況62
• 3.3.6 Citlr4 在不同刺激情況下表達(dá)模式62-65
• 3.3.7 草魚(yú)TLR4 對(duì)細(xì)菌侵襲的影響65
• 3.3.8 過(guò)表達(dá)CiTLR4 對(duì)下游基因表達(dá)的影響65-66
• 3.4 討論66-71
• 第四章 草魚(yú)易感和抗病群體腎臟關(guān)鍵miRNA篩選鑒定71-89
• 4.1 材料71
• 4.2 方法71-73
• 4.2.1 嗜水氣單胞菌感染草魚(yú)半數(shù)致死濃度的測(cè)定71
• 4.2.2 草魚(yú)易感和抗病群體篩選71
• 4.2.3 總RNA提取71
• 4.2.4 草魚(yú)易感和抗病群體腎臟small RNA高通量測(cè)序71-72
• 4.2.5 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建72
• 4.2.6 草魚(yú)腎細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)72
• 4.2.7 CIK細(xì)胞轉(zhuǎn)染72
• 4.2.8 過(guò)表達(dá)目的基因?qū)κ人畾鈫伟肭諧IK細(xì)胞的影響72
• 4.2.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR72
• 4.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析72-73
• 4.3 結(jié)果73-86
• 4.3.1 草魚(yú)腎臟易感和抗病群體small RNA測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量及長(zhǎng)度分析73-74
• 4.3.2 small RNA轉(zhuǎn)錄組定位和分類(lèi)注釋74-75
• 4.3.3 miRNA差異表達(dá)分析75-77
• 4.3.4 差異表達(dá)miRNA的qRT-PCR驗(yàn)證77-78
• 4.3.5 Citlr5 是cid-mi Rn-115 和miR-142a-3p的潛在靶基因78-80
• 4.3.6 Citlr5 調(diào)控mi RNA驗(yàn)證80-81
• 4.3.7 草魚(yú)Citlr5 基因組織表達(dá)模式81-82
• 4.3.8 Citlr5 在不同刺激情況下表達(dá)模式82-84
• 4.3.9 CiTLR5, cid-miRn-115 和mi R-142a-3p對(duì)細(xì)菌侵襲的影響84
• 4.3.10 過(guò)表達(dá)CiTLR5 對(duì)下游基因表達(dá)的影響84-86
• 4.4 討論86-89
• 第五章 草魚(yú)內(nèi)參miRNA篩選89-105
• 5.1 材料90-91
• 5.1.1 草魚(yú)樣品90-91
• 5.1.2 主要試劑及耗材91
• 5.1.3 主要儀器設(shè)備91
• 5.2 方法91
• 5.2.1 總RNA提取91
• 5.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR91
• 5.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析91
• 5.3 結(jié)果91-102
• 5.3.1 內(nèi)參基因初步篩選91-93
• 5.3.2 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析93-96
• 5.3.3 候選內(nèi)參miRNA基因的表達(dá)水平分析96-97
• 5.3.4 內(nèi)參基因驗(yàn)證97-102
• 5.4 討論102-105
• 小結(jié)105-106
• 參考文獻(xiàn)106-120
• 附錄120-121
• 博士在讀期間發(fā)表及投稿論文121-122
• 致謝122

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本文編號(hào)：774272