本文關鍵詞：草魚感染嗜水氣單胞菌miRNA篩選及其功能分析

  更多相關文章： 草魚 細菌性敗血癥 Toll樣受體信號通路 mi RNA

【摘要】：草魚(Ctenopharyngodon idellus)產(chǎn)量及產(chǎn)值在最近幾年一直位居我國和世界養(yǎng)殖魚類前列。人工養(yǎng)殖條件下的草魚病害較多,提高草魚抗病力是增加養(yǎng)殖產(chǎn)量的重要途徑之一。草魚抗病性能差異與遺傳有關。從轉(zhuǎn)錄組水平探索草魚易感和抗病群體間的差異表達基因,對于解析不同群體間的差異及揭示形成該差異的分子機理具有重要作用。本論文通過嗜水氣單胞菌人工感染草魚,分別構建草魚易感和抗病群體。利用高通量測序技術分析草魚易感和抗病群體腎臟脾臟中的差異表達mi RNA和m RNA。篩選其中的關鍵mi RNA和m RNA,對其調(diào)控關系和功能進行分析鑒定。主要研究結果如下:1.草魚易感和抗病群體轉(zhuǎn)錄組測序分析利用Hiseq 2000技術平臺對草魚易感和抗病群體腎臟脾臟文庫進行高通量測序,在易感和抗病群體文庫分別獲得了7.09 G和6.13 G數(shù)據(jù)量。對測序數(shù)據(jù)進行過濾、拼接和組裝后共獲得199,554個轉(zhuǎn)錄本,其中28,311個轉(zhuǎn)錄本注釋為己知功能蛋白。在草魚易感和抗病群體中共有721個顯著差異表達的基因。相對于易感群體,在抗病群體中有475個差異基因為上調(diào)表達,246個為下調(diào)表達。生物學功能和信號通路富集分析表明,差異表達基因主要富集到免疫相關信號通路。2.草魚易感和抗病群體脾臟關鍵mi RNA篩選鑒定利用Hiseq 2000技術平臺對草魚脾臟易感與抗病群體2個small RNA文庫進行高通量測序和表達模式分析。通過比對mi Rbase 19.0數(shù)據(jù)庫,獲得61個已知mi RNA,預測得到124個新mi RNA。分析這185個mi RNA表達情況,表明mi R-451在易感群體中表達量最高,mi R-101a在抗病群體中表達量最高,cid-mi Rn-85在兩個群體中的差異倍數(shù)最大(4.12倍)。在草魚易感和抗病群體中,共發(fā)現(xiàn)21個mi RNA表達情況具有顯著差異,其中5個mi RNA在易感群體顯著高表達,16個在抗病群體顯著高表達。21個差異表達mi RNA共預測得到287個靶基因,對這些靶基因的功能進行富集發(fā)現(xiàn)其中有35條通路與免疫功能相關。對草魚易感群體中高表達的5個mi RNA進行后續(xù)分析。草魚組織表達模式分析表明,lei-7i和cid-mi Rn-118在免疫相關組織腎臟和脾臟高表達,cid-mi Rn-3和mi R-451在血液中高表達。細菌感染草魚過程中,let-7i、cid-mi Rn-118、cid-mi Rn-3和mi R-451均呈現(xiàn)出動態(tài)表達模式。使用mi Randa軟件預測lei-7i和cid-mi Rn-118在草魚中的潛在靶基因。利用雙熒光素酶報告系統(tǒng)和過表達試驗,驗證lei-7i和cid-mi Rn-118通過靶向Citlr4和Cinfil3-6基因3‘非編碼區(qū)抑制Citlr4和Cinfil3-6基因表達。組織表達譜分析發(fā)現(xiàn),草魚Citlr4基因在脾臟和腎臟中顯著高表達。細菌和病毒均可影響Citlr4的表達水平。過表達草魚Citlr4基因可以激活下游免疫相關基因il-1β,il-8和TNF-α。3.草魚易感和抗病群體腎臟關鍵mi RNA篩選鑒定利用Hiseq 2000技術平臺對草魚腎臟易感和抗病群體2個small RNA文庫進行高通量測序和表達模式分析。通過比對mi Rbase 19.0數(shù)據(jù)庫,獲得97個已知mi RNA,預測到95個新mi RNA。分析這192個mi RNA的表達情況,發(fā)現(xiàn)mi R-101a在易感和抗病群體中的表達量均為最高,cid-mi Rn-154在兩個群體中的差異倍數(shù)最大(5.19倍)。在草魚易感和抗病群體中,共發(fā)現(xiàn)9個mi RNA表達情況具有顯著差異,其中3個mi RNA在易感群體高表達,6個在抗病群體高表達。9個差異表達mi RNA共預測得到188個靶基因,對這些靶基因的功能進行富集發(fā)現(xiàn)有26條與免疫功能相關。對草魚易感和抗病群體中9個差異表達mi RNA進行后續(xù)分析。草魚組織表達譜分析表明,他們在6個免疫相關組織中均有表達。使用mi Randa軟件對靶基因進行預測,發(fā)現(xiàn)mi R-142a-3p、mi R-21、mi R-223、cid-mi Rn-115和cid-mi Rn-131在Citlr5基因的3’UTR區(qū)域均有靶位點。進行草魚組織表達譜和草魚腎細胞受鞭毛蛋白刺激實驗分析,結果表明mi R142a-3p、cid-mi Rn-115與Citlr5的表達模式呈負相關。草魚腎細胞中過表達mi R-142a-3p和cid-mi Rn-115,結果表明Citlr5基因表達水平被抑制。組織表達譜分析發(fā)現(xiàn),Citlr5基因在肝臟和脾臟中顯著高表達。在草魚腎細胞中,細菌和病毒均可影響Citlr5的表達水平。在草魚腎細胞中,過表達草魚Citlr5基因可以激活下游免疫相關基因il-1β、il-8和TNF-α。4.草魚mi RNA內(nèi)參基因篩選鑒定用2個常用的內(nèi)參基因18s r RNA、β-actin和草魚中高表達的7個mi RNA作為候選內(nèi)參。使用ge Norm v.3.5、Norm Finder、Best Keeper和comparative deltaCt四種軟件程序,對9個候選內(nèi)參在草魚18個胚胎發(fā)育階段和12個組織的穩(wěn)定性進行了計算。在未受精卵至原腸期階段,mi R-126-3p顯示最為穩(wěn)定;在眼囊出現(xiàn)期至孵化后10天,mi R-22a最為穩(wěn)定。確定了不同組織中的穩(wěn)定表達的mi RNA:在血液和肝臟中最穩(wěn)定的是mi R-126-3p,鰓中是mi R-101a,腎臟中是mi R-192,腸是mi R-451,在腦、頭腎、脾臟、心臟、肌肉、皮膚和鰭條中mi R-22a最為穩(wěn)定。
【關鍵詞】：草魚 細菌性敗血癥 Toll樣受體信號通路 mi RNA
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S943
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 引言14-15
• 第一章 文獻綜述15-23
• 1.1 Toll樣受體生物學功能15-17
• 1.1.1 TLR結構和分布15-16
• 1.1.2 TLR的模式識別作用16-17
• 1.2 TLR信號傳遞途徑17-20
• 1.2.1 依賴MyD88 途徑17
• 1.2.2 非依賴MyD88 途徑17-18
• 1.2.3 TLR信號通路下游的炎性因子18-19
• 1.2.4 TLR信號通路的負向調(diào)控19-20
• 1.3 魚類toll樣受體的生物學功能研究20-21
• 1.3.1 魚類TLRs的類型和結構特征20-21
• 1.3.2 魚類TLR的配體特異性及其信號途徑21
• 1.4 Toll樣受體信號通路與細菌疾病相關的研究21-23
• 第二章 草魚轉(zhuǎn)錄組表達譜分析23-46
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 草魚樣品23
• 2.1.2 細菌及細胞23-24
• 2.1.3 質(zhì)粒和菌株24
• 2.1.4 主要試劑及耗材24-25
• 2.1.5 主要儀器設備25
• 2.2 方法25-29
• 2.2.1 嗜水氣單胞菌感染草魚半數(shù)致死濃度測定25-26
• 2.2.2 草魚易感和抗病群體篩選26
• 2.2.3 總RNA提取26
• 2.2.4 草魚易感和抗病群體脾臟腎臟轉(zhuǎn)錄組高通量測序26-27
• 2.2.5 實時熒光定量PCR27-29
• 2.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析29
• 2.3 結果29-45
• 2.3.1 總RNA質(zhì)量檢測29-30
• 2.3.2 轉(zhuǎn)錄組組裝結果和分析30-32
• 2.3.3 unigene功能注釋和預測編碼蛋白框32-34
• 2.3.4 GO功能分類和代謝通路分析34-36
• 2.3.5 Unigene表達差異分析36-39
• 2.3.6 miRNA與mRNA整合分析39-45
• 2.4 討論45-46
• 第三章 草魚易感和抗病群體脾臟關鍵miRNA篩選鑒定46-71
• 3.1 材料46
• 3.2 方法46-53
• 3.2.1 嗜水氣單胞菌感染草魚半數(shù)致死濃度的測定46-47
• 3.2.2 草魚易感和抗病群體篩選47
• 3.2.3 總RNA提取47
• 3.2.4 草魚易感和抗病群體脾臟small RNA高通量測序47-48
• 3.2.5 載體構建48-51
• 3.2.6 草魚腎細胞系細胞培養(yǎng)51
• 3.2.7 CIK細胞轉(zhuǎn)染51-52
• 3.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測52
• 3.2.9 過表達目的基因?qū)κ人畾鈫伟肭諧IK細胞的影響52-53
• 3.2.10 實時熒光定量PCR53
• 3.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析53
• 3.3 結果53-66
• 3.3.1 草魚脾臟易感和抗病small RNA測序質(zhì)量及長度分布53-55
• 3.3.2 miRNAs差異表達分析55-58
• 3.3.3 miRNA靶基因預測及富集分析58-60
• 3.3.4 cid-miRn-118 和let-7i靶基因驗證60-62
• 3.3.5 Citlr4 在不同組織中的表達情況62
• 3.3.6 Citlr4 在不同刺激情況下表達模式62-65
• 3.3.7 草魚TLR4 對細菌侵襲的影響65
• 3.3.8 過表達CiTLR4 對下游基因表達的影響65-66
• 3.4 討論66-71
• 第四章 草魚易感和抗病群體腎臟關鍵miRNA篩選鑒定71-89
• 4.1 材料71
• 4.2 方法71-73
• 4.2.1 嗜水氣單胞菌感染草魚半數(shù)致死濃度的測定71
• 4.2.2 草魚易感和抗病群體篩選71
• 4.2.3 總RNA提取71
• 4.2.4 草魚易感和抗病群體腎臟small RNA高通量測序71-72
• 4.2.5 過表達載體構建72
• 4.2.6 草魚腎細胞系細胞培養(yǎng)72
• 4.2.7 CIK細胞轉(zhuǎn)染72
• 4.2.8 過表達目的基因?qū)κ人畾鈫伟肭諧IK細胞的影響72
• 4.2.9 實時熒光定量PCR72
• 4.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析72-73
• 4.3 結果73-86
• 4.3.1 草魚腎臟易感和抗病群體small RNA測序數(shù)據(jù)質(zhì)量及長度分析73-74
• 4.3.2 small RNA轉(zhuǎn)錄組定位和分類注釋74-75
• 4.3.3 miRNA差異表達分析75-77
• 4.3.4 差異表達miRNA的qRT-PCR驗證77-78
• 4.3.5 Citlr5 是cid-mi Rn-115 和miR-142a-3p的潛在靶基因78-80
• 4.3.6 Citlr5 調(diào)控mi RNA驗證80-81
• 4.3.7 草魚Citlr5 基因組織表達模式81-82
• 4.3.8 Citlr5 在不同刺激情況下表達模式82-84
• 4.3.9 CiTLR5, cid-miRn-115 和mi R-142a-3p對細菌侵襲的影響84
• 4.3.10 過表達CiTLR5 對下游基因表達的影響84-86
• 4.4 討論86-89
• 第五章 草魚內(nèi)參miRNA篩選89-105
• 5.1 材料90-91
• 5.1.1 草魚樣品90-91
• 5.1.2 主要試劑及耗材91
• 5.1.3 主要儀器設備91
• 5.2 方法91
• 5.2.1 總RNA提取91
• 5.2.2 實時熒光定量PCR91
• 5.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析91
• 5.3 結果91-102
• 5.3.1 內(nèi)參基因初步篩選91-93
• 5.3.2 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析93-96
• 5.3.3 候選內(nèi)參miRNA基因的表達水平分析96-97
• 5.3.4 內(nèi)參基因驗證97-102
• 5.4 討論102-105
• 小結105-106
• 參考文獻106-120
• 附錄120-121
• 博士在讀期間發(fā)表及投稿論文121-122
• 致謝122

，

本文編號：774272