本文關(guān)鍵詞：煙草腋芽發(fā)育相關(guān)基因的克隆與功能分析

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【摘要】：植物分枝發(fā)育在植物形態(tài)建成中具有十分重要的地位。研究表明,植物的分枝發(fā)育過程受遺傳因素和環(huán)境條件等的共同影響。對植物側(cè)枝發(fā)育有顯著調(diào)控作用的基因大部分屬于GRAS、TCP或R2R3-MYB基因家族,這三個基因家族均編碼植物轉(zhuǎn)錄因子。其中,GRAS基因家族成員在植物生長發(fā)育的許多方面發(fā)揮重要的作用;TCP家族是一類與植物器官三維形態(tài)發(fā)育以及細胞周期調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子;R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的初生和次生代謝、響應(yīng)生物和非生物脅迫等過程。本研究對煙草全基因組內(nèi)GRAS和TCP基因家族進行了鑒定和生物信息學(xué)分析,在此基礎(chǔ)上,分別克隆了屬于GRAS基因家族的煙草Nt LS基因、屬于TCP基因家族的Nt BRC1-Like基因和屬于R2R3-MYB基因家族的Nt RAX2基因,它們的直系同源基因都與植物側(cè)枝發(fā)育相關(guān)。對Nt LS和Nt RAX2基因進行過表達分析、基因沉默研究以及擬南芥互補實驗驗證,探索其對煙草腋芽發(fā)生和發(fā)育的影響,為利用遺傳操作培育無腋芽或少腋芽的煙草新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。本文獲得的主要結(jié)果如下:(1)在煙草基因組中鑒定了95個GRAS家族成員,根據(jù)系統(tǒng)進化的分析結(jié)果將它們分為十個亞家族。所有的Nt GRAS成員都含有5個高度保守的motif,分別是LHR I、VHIID、LHR II、PFYRE和SAW。該基因家族中約88.42%的基因沒有內(nèi)含子,有定位信息的84個成員分布在煙草的22條染色體上。煙草GRAS基因參與很多生物學(xué)過程的調(diào)控,約74%的Nt GRAS蛋白是細胞核定位。被選取進行熒光定量分析的22個Nt GRAS基因中大多數(shù)在根和葉片的表達量最高。(2)在煙草基因組中鑒定了61個TCP家族成員,根據(jù)系統(tǒng)進化的分析結(jié)果將它們分為Class I和Class II兩個亞家族,其中Class II又可以分為CIN和CYC/TB1亞簇。所有的Nt TCP蛋白都含有高度保守的TCP-domian,有12個成員還另外包含一個R-domian,這12個Nt TCP蛋白中有10個屬于CYC/TB1亞簇。該基因家族中約67.2%的基因沒有內(nèi)含子,有定位信息的54個成員分布在煙草的20條染色體上。被選取進行熒光定量分析的22個Nt TCP基因中絕大多數(shù)在葉片的表達量最高。(3)從普通煙草中克隆了Nt LS基因的2條拷貝,Nt LS-S和Nt LS-T,前者來自于林煙草,后者來自于絨毛狀煙草。二者序列極為相似,且都沒有內(nèi)含子,分別與GRAS基因家族中的Nt LS和Nt LSa基因相對應(yīng)。Nt LS-S和Nt LS-T基因的表達模式與番茄Le LS、擬南芥At LAS和菊花Dg LSL的表達模式相似。對Nt LS基因構(gòu)建過表達載體和CRES-T載體并進行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得的T0代過表達轉(zhuǎn)基因煙草比非轉(zhuǎn)基因煙草更早出現(xiàn)腋芽,而且Nt LS-S基因能恢復(fù)擬南芥las突變體的表型。(4)從普通煙草中克隆了4個Nt BRC1-Like基因,命名為Nt BRC1-Like1、2、3和4,分別與TCP基因家族中的Nt TCP18a、b、c和d相對應(yīng)。這4個基因?qū)儆谂c植物側(cè)枝發(fā)育相關(guān)的CYC/TB1亞家族,且Nt BRC1-Like1/4、Nt BRC1-Like2/3兩兩的遺傳距離較近。4個Nt BRC1-Like基因編碼的蛋白除具有核心的TCP-domain外,還具有CYC/TB1簇蛋白特有的R-domain。4個Nt BRC1-Like基因在不同的組織中呈現(xiàn)特異性表達,且其表達模式可分為兩種:1和4的表達模式相似,在腋芽中高度表達;2和3的表達模式十分相像,在葉和腋芽中的表達量都顯著高于其它組織。Nt BRC1-Like2和3被證實是Nt BRC1b基因分別來自于林煙草和絨毛狀煙草的2條拷貝,Nt BRC1b-S和Nt BRC1b-T。為了探索Nt BRC1b基因的功能,對其構(gòu)建了過表達載體,正在研究其功能。(5)從普通煙草中克隆了Nt RAX2基因的2條拷貝,來自于林煙草的Nt RAX2-S和來自于絨毛狀煙草的Nt RAX2-T,二者序列高度相似。Nt RAX2-S和Nt RAX2-T在腋芽和花中高度表達,在花芽和莖尖中的表達也維持較高的水平。對Nt RAX2基因構(gòu)建過表達載體和CRES-T載體并進行遺傳轉(zhuǎn)化,獲得的T0代過表達轉(zhuǎn)基因煙草比非轉(zhuǎn)基因煙草更早出現(xiàn)腋芽,并且Nt RAX2-T能使擬南芥rax2突變體的表型得到恢復(fù)。
【關(guān)鍵詞】：煙草 腋芽 NtLS基因 NtBRC1-Like基因 NtRAX2基因
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S572
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 英文縮略表15-16
• 第一章 緒論16-29
• 1.1 高等植物莖的分枝發(fā)育16-17
• 1.1.1 莖分枝的形成16
• 1.1.2 植物分枝類型16-17
• 1.1.3 植物分枝發(fā)育的理化模式17
• 1.2 控制植物分枝發(fā)育的相關(guān)基因及調(diào)控機制17-24
• 1.2.1 腋芽起始階段的相關(guān)基因17-18
• 1.2.2 分枝發(fā)育的激素調(diào)控機制18-23
• 1.2.3 環(huán)境條件對植物分枝的影響23-24
• 1.3 與植物分枝發(fā)育相關(guān)的幾個重要基因家族的研究進展24-26
• 1.3.1 GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族研究進展24-25
• 1.3.2 TCP轉(zhuǎn)錄因子家族研究進展25
• 1.3.3 R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族研究進展25-26
• 1.4 嵌合抑制基因沉默技術(shù)26-27
• 1.5 本研究的目的意義和技術(shù)路線27-29
• 1.5.1 目的意義27
• 1.5.2 技術(shù)路線27-29
• 第二章 煙草GRAS基因家族分析與比較分析29-50
• 2.1 材料與方法29-31
• 2.1.1 基因組數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)序列來源29
• 2.1.2 煙草全基因組GRAS基因家族成員鑒定29-30
• 2.1.3 煙草GRAS蛋白的系統(tǒng)進化和保守結(jié)構(gòu)域分析30
• 2.1.4 NtGRAS基因的染色體定位30
• 2.1.5 NtGRAS蛋白亞細胞定位預(yù)測30
• 2.1.6 煙草GRAS基因家族的表達模式分析和GO分析30
• 2.1.7 熒光定量PCR（qRT-PCR）分析30-31
• 2.2 結(jié)果與分析31-48
• 2.2.1 煙草GRAS蛋白的鑒定與分類31-32
• 2.2.2 煙草GRAS家族系統(tǒng)進化及基因結(jié)構(gòu)分析32-35
• 2.2.3 GRAS基因家族的比較基因組分析35
• 2.2.4 煙草GRAS蛋白的序列特征及保守域分析35-41
• 2.2.5 煙草GRAS基因的染色體分布41-43
• 2.2.6 煙草GRAS蛋白的亞細胞定位43
• 2.2.7 煙草GRAS基因的表達模式分析與GO分析43-46
• 2.2.8 熒光定量PCR（qRT-PCR）分析46-48
• 2.3 討論48-50
• 第三章 煙草TCP基因家族分析與比較分析50-66
• 3.1 材料與方法50-51
• 3.1.1 基因組數(shù)據(jù)庫和蛋白質(zhì)序列來源50
• 3.1.2 煙草全基因組TCP基因家族成員鑒定50
• 3.1.3 煙草TCP蛋白的系統(tǒng)進化和保守結(jié)構(gòu)域分析50
• 3.1.4 NtTCP基因的染色體定位50
• 3.1.5 NtTCP蛋白亞細胞定位預(yù)測50-51
• 3.1.6 煙草TCP基因家族的表達模式分析51
• 3.1.7 熒光定量PCR（qRT-PCR）分析51
• 3.2 結(jié)果與分析51-64
• 3.2.1 煙草TCP蛋白的鑒定與分類51-52
• 3.2.2 煙草TCP家族系統(tǒng)進化分析及基因結(jié)構(gòu)分析52-54
• 3.2.3 煙草TCP基因家族的比較基因組分析54-55
• 3.2.4 煙草TCP蛋白的序列特征及保守域分析55-59
• 3.2.5 煙草TCP基因的染色體分布59-60
• 3.2.6 煙草TCP蛋白的亞細胞定位60-61
• 3.2.7 煙草TCP基因的表達模式分析61-63
• 3.2.8 熒光定量PCR（qRT-PCR）分析63-64
• 3.3 討論64-66
• 第四章 煙草LS基因的克隆與功能分析66-91
• 4.1 材料和試劑66-69
• 4.1.1 材料66-68
• 4.1.2 主要試劑和藥品68-69
• 4.2 試驗方法69-78
• 4.2.1 NtLS基因的克隆69-72
• 4.2.2 NtLS基因的序列分析72
• 4.2.3 NtLS基因的表達模式分析72-73
• 4.2.4 NtLS基因表達載體的構(gòu)建73-74
• 4.2.5 過表達載體的遺傳轉(zhuǎn)化74-78
• 4.2.6 CRES-T表達載體的煙草遺傳轉(zhuǎn)化78
• 4.3 結(jié)果與分析78-89
• 4.3.1 煙草總RNA的純度和完整性檢測78-79
• 4.3.2 NtLS基因的克隆79
• 4.3.3 NtLS基因雙拷貝的序列分析79-81
• 4.3.4 NtLS基因的熒光定量表達分析81-82
• 4.3.5 普通煙草過表達NtLS基因的研究82-85
• 4.3.6 NtLS-S基因?qū)M南芥las突變體的互補作用85-88
• 4.3.7 NtLS及其所在家族其它成員的基因沉默研究88-89
• 4.4 討論89-91
• 第五章 煙草BRANCHED1-Like基因的克隆與表達載體構(gòu)建91-104
• 5.1 材料91-93
• 5.1.1 數(shù)據(jù)與軟件91-92
• 5.1.2 植物材料92
• 5.1.3 主要試劑92-93
• 5.2 試驗方法93-94
• 5.2.1 NtBRC1-Like基因的電子克隆路線93
• 5.2.2 NtBRC1-Like基因cDNA的獲得93
• 5.2.3 NtBRC1-Like蛋白序列分析93
• 5.2.4 NtBRC1-Like蛋白的保守結(jié)構(gòu)域與系統(tǒng)進化分析93-94
• 5.2.5 煙草BRC1-Like基因的表達模式分析94
• 5.2.6 過表達載體的構(gòu)建與農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化94
• 5.3 結(jié)果與分析94-102
• 5.3.1 NtBRC1-Like基因全長cDNA的獲得94-95
• 5.3.2 NtBRC1-Like基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析95
• 5.3.3 NtBRC1-Like蛋白的結(jié)構(gòu)特征分析95-96
• 5.3.4 NtBRC1-Like蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及磷酸化位點分析96-97
• 5.3.5 NtBRC1-Like蛋白的保守結(jié)構(gòu)域與系統(tǒng)進化分析97-99
• 5.3.6 NtBRC1-Like基因的表達模式分析99-100
• 5.3.7 NtBRC1-Like2和NtBRC1-Like3基因的序列分析100-101
• 5.3.8 過表達載體的構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化101-102
• 5.4 討論102-104
• 第六章 煙草RAX2基因的克隆與功能分析104-117
• 6.1 材料和試劑104
• 6.1.1 材料104
• 6.1.2 主要試劑和藥品104
• 6.2 試驗方法104-106
• 6.2.1 NtRAX2基因的克隆104-105
• 6.2.2 NtRAX2基因的序列分析105
• 6.2.3 NtRAX2基因的表達模式分析105
• 6.2.4 NtRAX2基因表達載體的構(gòu)建105-106
• 6.2.5 過表達載體的遺傳轉(zhuǎn)化106
• 6.2.6 CRES-T表達載體的煙草遺傳轉(zhuǎn)化106
• 6.3 結(jié)果與分析106-115
• 6.3.1 NtRAX2基因的克隆106-107
• 6.3.2 NtRAX2基因雙拷貝的序列分析107-109
• 6.3.3 NtRAX2基因的熒光定量表達分析109
• 6.3.4 普通煙草過表達NtRAX2基因的研究109-112
• 6.3.5 NtRAX2-T基因?qū)M南芥rax2突變體的互補作用112-114
• 6.3.6 NtRAX2及其所在家族其它成員的基因沉默研究114-115
• 6.4 討論115-117
• 第七章 全文結(jié)論與展望117-119
• 參考文獻119-128
• 附錄128-136
• 致謝136-137
• 作者簡歷137-138

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1 安新民,張上隆,徐昌杰;柑桔轉(zhuǎn)化酶基因家族新成員的克隆和序列分析[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)科學(xué)版);2003年01期

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本文編號：710482