本文關(guān)鍵詞：與弓形蟲微線體蛋白互作的宿主蛋白的篩選和鑒定

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【摘要】：剛地弓形蟲是頂復門寄生蟲中的一種專性細胞內(nèi)寄生原蟲,是非常重要的人畜共患病原。弓形蟲生活史復雜,包括人類在內(nèi)的幾乎所有溫血動物均可以作為中間宿主而感染。弓形蟲如此廣泛的宿主范圍與其成功的宿主細胞入侵和調(diào)節(jié)機制密切相關(guān)。在弓形蟲入侵和調(diào)節(jié)宿主細胞的過程中,蟲體微線體分泌的微線體蛋白可以黏附宿主細胞并對宿主細胞起到重要的調(diào)節(jié)作用。盡管多數(shù)微線體蛋白均含有不同的黏附結(jié)構(gòu)域,但與微線體蛋白互作的宿主蛋白仍知之甚少,所以鑒定與微線體蛋白特異互作的宿主蛋白可以為進一步闡釋弓形蟲入侵和調(diào)節(jié)宿主的機制提供理論依據(jù),同時為宿主蛋白在病原感染時的作用研究奠定基礎。為此,本研究從病原與宿主相互作用的角度出發(fā),以弓形蟲微線體蛋白AMA1、MIC2和MIC3為誘餌,利用酵母雙雜交技術(shù)篩選鼠c DNA文庫,得到了2個與MIC2整合素A樣結(jié)構(gòu)域相互作用的宿主蛋白,8個與MIC3相互作用的宿主蛋白。在此基礎上,利用不同的蛋白質(zhì)互作方法驗證了微線體蛋白MIC3與宿主蛋白Spata3和Dkk2在體內(nèi)、體外的相互作用。之后,對宿主篩選蛋白Dkk2所在的Wnt信號通路進行研究,探索弓形蟲對宿主細胞該通路的影響。(1)與弓形蟲微線體蛋白相互作用宿主蛋白的篩選利用特異引物從弓形蟲RH株速殖子c DNA中擴增微線體蛋白AMA1的胞外域,MIC2的胞外域和MIC3全長編碼序列。利用擴增獲得的微線體蛋白序列構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒,并檢測誘餌質(zhì)粒在酵母中的表達,自激活和毒性。由于MIC2胞外域誘餌質(zhì)粒對酵母雙雜交系統(tǒng)存在自激活,因此將其截短成兩個結(jié)構(gòu)域——整合素A樣結(jié)構(gòu)域(A/I)和血小板反應蛋白重復序列結(jié)構(gòu)域(TSR),并構(gòu)建誘餌質(zhì)粒。通過自激活檢測發(fā)現(xiàn),TSR結(jié)構(gòu)域是導致MIC2出現(xiàn)自激活的重要結(jié)構(gòu)域,因此用A/I結(jié)構(gòu)域進行宿主蛋白篩選。通過酵母接合的方式對鼠c DNA文庫進行篩選,得到2個可以與MIC2-A/I相互作用的宿主蛋白,分別為鼠LAMTOR1和RNase H2b;得到8個可以與MIC3相互作用的宿主蛋白,分別為鼠的Svil,Phf7,Dkk2,Tmem100,Spata3 iso2,Spata3 iso3和兩個非典型蛋白LOC72128,LOC210940;未篩選到與AMA1相互作用的宿主蛋白。(2)MIC3陽性互作的驗證利用MIC3篩選的宿主蛋白編碼序列設計引物,從鼠c DNA中成功擴增得到Phf7,Dkk2,Tmem100和Spata3 iso3全長編碼序列,從文庫質(zhì)粒中擴增得到Svil和兩個非典型蛋白的文庫插入片段序列。分別構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒,并與構(gòu)建在p GADT7的MIC3進行點對點驗證,發(fā)現(xiàn)MIC3與Dkk2,Spata3全長以及兩個非典型蛋白文庫插入片段存在相互作用。此外,將MIC3連入原核表達載體融合表達GST-MIC3蛋白,將宿主蛋白Spata3、Dkk2連入另一種原核表達載體融合表達His-Spata3和His-Dkk2蛋白。分別純化蛋白并用GST-Pull down驗證了MIC3與宿主蛋白Spata3,Dkk2在體外存在相互作用。將MIC3和宿主蛋白Spata3,Dkk2分別連接入不同的真核表達載體構(gòu)建重組質(zhì)粒,利用免疫共沉淀和雙分子熒光互補驗證了MIC3與宿主蛋白Spata3,Dkk2在哺乳動物細胞內(nèi)存在相互作用。(3)MIC3與宿主蛋白互作結(jié)構(gòu)域的確定根據(jù)文獻報道和生物信息學分析將全長MIC3分為兩個結(jié)構(gòu)域——幾丁質(zhì)結(jié)合樣結(jié)構(gòu)域(CBL)和表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF)。分別將這兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)建至p GADT7載體,利用酵母雙雜交點對點與MIC3篩選的宿主蛋白誘餌質(zhì)粒進行相互作用鑒定。結(jié)果顯示,CBL結(jié)構(gòu)域不能與任何篩選宿主蛋白相互作用;與全長MIC3相同,EGF結(jié)構(gòu)域可以同宿主蛋白Spata3,Dkk2和兩個非典型蛋白進行相互作用,說明EGF結(jié)構(gòu)域是MIC3與宿主蛋白相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。(4)弓形蟲對宿主Wnt/β-catenin信號通路的影響由于MIC3篩選的宿主蛋白Dkk2具有調(diào)節(jié)宿主Wnt/β-catenin信號通路的功能,因此我們研究弓形蟲對宿主該信號通路的影響。利用TOP-Flash螢火蟲熒光素酶報告基因系統(tǒng)進行檢測,發(fā)現(xiàn)弓形蟲不同感染豐度都不能對宿主Wnt信號轉(zhuǎn)導產(chǎn)生明顯的影響;同時構(gòu)建MIC3真核表達質(zhì)粒,利用MIC3真核表達蛋白刺激宿主細胞進行檢測,發(fā)現(xiàn)MIC3蛋白對宿主該信號轉(zhuǎn)導也無明顯影響;通過Western blot對弓形蟲速殖子感染或MIC3蛋白表達的宿主細胞進行分析,發(fā)現(xiàn)弓形蟲速殖子和MIC3蛋白不能使Wnt信號通路關(guān)鍵元件β-catenin的表達量出現(xiàn)明顯變化。以上結(jié)果表明,弓形蟲速殖子和MIC3蛋白不能對宿主Wnt/β-catenin信號通路產(chǎn)生影響。本研究利用多種蛋白質(zhì)互作技術(shù)對與弓形蟲微線體蛋白互作的宿主蛋白進行篩選和鑒定,并探索弓形蟲對宿主生長發(fā)育重要信號通路的影響。該研究不僅加深了我們對弓形蟲入侵和感染宿主機制的理解,更為弓形蟲新型藥物和疫苗的開發(fā)提供了理論基礎。
【關(guān)鍵詞】：弓形蟲 微線體蛋白 蛋白互作 宿主蛋白 Spata3 Dkk2
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.7
【目錄】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-13
• 縮略表13-15
• 1 文獻綜述15-34
• 1.1 弓形蟲概述15-18
• 1.1.1 弓形蟲及弓形蟲病15-16
• 1.1.2 弓形蟲的生活史16-17
• 1.1.3 弓形蟲的宿主17-18
• 1.2 弓形蟲感染宿主機制的研究進展18-21
• 1.2.1 弓形蟲入侵宿主細胞的過程18-20
• 1.2.2 弓形蟲對宿主細胞的調(diào)節(jié)20-21
• 1.3 弓形蟲微線體蛋白的研究進展21-28
• 1.3.1 MIC1/MIC4/MIC6 復合物25
• 1.3.2 MIC2/M2AP復合物25-26
• 1.3.3 MIC3/MIC8 復合物26
• 1.3.4 AMA1 以及移動接點復合物26-27
• 1.3.5 其他微線體蛋白27-28
• 1.4 弓形蟲蛋白與宿主蛋白相互作用的研究進展28-29
• 1.5 蛋白質(zhì)互作技術(shù)的研究進展29-34
• 1.5.1 酵母雙雜交29-31
• 1.5.2 免疫共沉淀31
• 1.5.3 Pull-down31-32
• 1.5.4 雙分子熒光互補32-34
• 2 研究目的與意義34-35
• 3 材料與方法35-62
• 3.1 實驗材料35-38
• 3.1.1 實驗動物35
• 3.1.2 蟲株、菌株和細胞35
• 3.1.3 載體與質(zhì)粒35-37
• 3.1.4 引物37-38
• 3.2 主要儀器與試劑38-42
• 3.2.1 主要儀器38-39
• 3.2.2 主要試劑盒39
• 3.2.3 主要試劑39-40
• 3.2.4 主要溶液的配制40-42
• 3.3 實驗方法42-62
• 3.3.1 弓形蟲RH株速殖子的培養(yǎng)、收集與純化42-43
• 3.3.2 弓形蟲RH株基因組DNA的提取43
• 3.3.3 弓形蟲RH株速殖子總RNA的提取43-44
• 3.3.4 弓形蟲RH株速殖子cDNA的制備44
• 3.3.5 弓形蟲微線體蛋白AMA1、MIC2 和MIC3 編碼序列的獲得44-45
• 3.3.6 重組載體的構(gòu)建45-48
• 3.3.7 酵母雙雜交48-53
• 3.3.8 與微線體蛋白MIC3 互作的宿主蛋白編碼序列的獲得53
• 3.3.9 原核表達與表達產(chǎn)物的純化53-56
• 3.3.10 GST Pull-down56-57
• 3.3.11 哺乳動物細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染57-58
• 3.3.12 免疫共沉淀58-59
• 3.3.13 Western blot59
• 3.3.14 雙分子熒光互補59-60
• 3.3.15 弓形蟲速殖子對宿主Wnt/β-catenin信號通路的影響60
• 3.3.16 微線體蛋白MIC3 對宿主Wnt/β-catenin信號通路的影響60-62
• 4 結(jié)果與分析62-97
• 4.1 弓形蟲微線體蛋白AMA1，MIC2 和MIC3 編碼基因的分析和獲得62-64
• 4.1.1 弓形蟲微線體蛋白AMA1，MIC2 和MIC3 蛋白初級結(jié)構(gòu)的分析62-63
• 4.1.2 弓形蟲微線體蛋白AMA1，，MIC2 和MIC3 編碼基因的獲得63-64
• 4.2 酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建，表達，自激活和毒性檢測64-70
• 4.2.1 酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建64
• 4.2.2 酵母質(zhì)粒在酵母中的表達檢測64-65
• 4.2.3 誘餌質(zhì)粒的自激活和毒性檢測65-66
• 4.2.4 MIC2 不同結(jié)構(gòu)域酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建66-68
• 4.2.5 MIC2 不同結(jié)構(gòu)域誘餌質(zhì)粒在酵母中的表達檢測68-69
• 4.2.6 MIC2 不同結(jié)構(gòu)域誘餌質(zhì)粒的自激活和毒力檢測69-70
• 4.3 酵母雙雜交篩選與弓形蟲微線體蛋白AMA1、MIC2 和MIC3 相互作用的宿主蛋白70-76
• 4.3.1 宿主互作蛋白的初步篩選70-71
• 4.3.2 候選陽性克隆插入片段大小的鑒定及質(zhì)粒拯救71-73
• 4.3.3 候選陽性互作的回返驗證73
• 4.3.4 陽性插入片段的測序鑒定73-75
• 4.3.5 陽性互作宿主蛋白的GO分類分析75-76
• 4.4 MIC3 與篩選宿主蛋白互作的驗證76-90
• 4.4.1 MIC3 篩選宿主蛋白編碼基因的獲得76-78
• 4.4.2 MIC3 與篩選宿主蛋白的酵母點對點驗證78-79
• 4.4.3 MIC3 與宿主蛋白Spata3，Dkk2 相互作用的體外Pull-down驗證79-85
• 4.4.4 免疫共沉淀驗證MIC3 與宿主蛋白Spata3 和Dkk2 的相互作用85-88
• 4.4.5 雙分子熒光互補驗證MIC3 與宿主蛋白Spata3 和Dkk2 的相互作用88-90
• 4.5 MIC3 與宿主蛋白互作結(jié)構(gòu)域的鑒定90-92
• 4.6 弓形蟲對宿主Wnt/β-catenin信號通路的影響92-97
• 4.6.1 弓形蟲速殖子對宿主Wnt信號轉(zhuǎn)導的影響92-93
• 4.6.2 微線體蛋白MIC3 對宿主Wnt信號轉(zhuǎn)導的影響93-95
• 4.6.3 弓形蟲速殖子和MIC3 蛋白對宿主Wnt信號調(diào)控因子 β-catenin表達量的影響95-97
• 5 討論97-106
• 5.1 與弓形蟲微線體蛋白互作宿主蛋白的篩選97-101
• 5.1.1 鑒定與弓形蟲微線體蛋白AMA1、MIC2 和MIC3 互作的宿主蛋白的重要性97-98
• 5.1.2 酵母雙雜交系統(tǒng)的選擇、應用98-99
• 5.1.3 誘餌質(zhì)粒的自激活和毒性檢測99-100
• 5.1.4 宿主蛋白的初步篩選100-101
• 5.2 MIC3 陽性互作的驗證以及功能分析101-102
• 5.3 MIC3 互作結(jié)構(gòu)域的鑒定102-103
• 5.4 弓形蟲對宿主Wnt信號通路的影響103-106
• 6 總結(jié)106-107
• 參考文獻107-122
• 致謝122-124
• 附錄 1124-131
• 附錄 2131-132

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：706372