本文關(guān)鍵詞：miR156在光葉百脈根中的功能研究及百脈根轉(zhuǎn)錄組深度測序分析

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【摘要】：百脈根(Lotus corniculatus L.,簡寫Lotus corniculatus)是豆科(Leguminosae)百脈根屬(Lotus)多年生草本植物,廣泛分布于歐洲、亞洲、北美洲和大洋洲等地。由于莖葉柔軟,細(xì)嫩多汁,適口性好,產(chǎn)草量高,耐牧性好,所以百脈根已成為目前世界上最優(yōu)良的牧草之一。次生代謝產(chǎn)物黃酮類化合物和類胡蘿卜素是影響百脈根牧草質(zhì)量的兩大類關(guān)鍵物質(zhì)。有研究表明,植物界中保守的miR156家族既可以調(diào)控植物器官中黃酮類物質(zhì)和類胡蘿卜素的含量,又具有影響地上莖分支多少、增加植株生物量、延遲開花等作用。目前雖然在不同植物中對miR156的功能展開了大量研究,但對其自身的調(diào)控機制還不是十分清楚。本工作首先從模式物種光葉百脈根(Lotus corniculatus L. var. japonicus Regel,簡寫Lotus japonicus)中克隆了百脈根miR156前體基因,并通過在光葉百脈根中過表達(dá)該基因驗證了miR156的真實性及其功能。進(jìn)一步通過生物信息學(xué)方法鑒定了多條miR156靶標(biāo)基因,初步闡明了百脈根屬植物中可能存在的miR156調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。同時,借助第二代高通量測序技術(shù)對百脈根的轉(zhuǎn)錄組和基因表達(dá)譜進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)了多個與黃酮類物質(zhì)合成途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶和轉(zhuǎn)錄因子基因。本研究為闡明miR156及其靶基因構(gòu)成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的證據(jù),也為利用miR156對靶標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用提升百脈根中黃酮類物質(zhì)和類胡蘿卜素的含量及牧草產(chǎn)量打下了基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下；1.根據(jù)擬南芥Pre-AtmiR156前體序列從光葉百脈根基因組中克隆了一條Pri-LjmiR156a前體序列。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,獲得了兩個獨立的miR156過表達(dá)株系。表型和生化分析結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因植株的生物量明顯 增加,開花受到抑制,類黃酮代謝產(chǎn)物的分布也發(fā)生了改變。由于轉(zhuǎn)基因植株的開花時間明顯推遲,導(dǎo)致不能產(chǎn)生足夠數(shù)量的種子。另外,個體與根瘤菌的共生作用也受到影響。相較于野生型植株,過表達(dá)植株只能生成50%左右的根瘤。2.利用生物信息學(xué)方法在光葉百脈根基因組中確定了多個miR156靶標(biāo)基因,其中包括多條SPL家族基因。這些SPL基因的活性在miR156過表達(dá)植株中受到了選擇性的抑制。通過改進(jìn)的5'-RACE (Rapid amplification of cDNA ends)方法,證實LjmiR156能夠識別TC70253、AU089181和TC57859等三個預(yù)測的靶標(biāo)基因,并導(dǎo)致其信使RNA在百脈根中被剪切。通過檢測植物與根瘤菌共生作用中關(guān)鍵基因的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)在根瘤菌接種初期ENOD40-1、ENOD40-2、POLLUX和CYCLOPS等多個蛋白質(zhì)編碼基因受到miR156的抑制。3.為了在牧草中進(jìn)一步研究miR156的調(diào)控作用,本工作借助高通量測序技術(shù)獲得了大量的百脈根遺傳信息。通過對百脈根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,得到了45,698條unigene,發(fā)現(xiàn)了150條與黃酮類化合物積累有關(guān)的unigene,覆蓋了整個已知的黃酮類化合物生物合成途徑。對豆科植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索比對,發(fā)現(xiàn)2,998條百脈根unigene含有轉(zhuǎn)錄因子特征區(qū)域。其中unigene322、C12952.Contigl-2、Unigene19239和Unigene2664分別為擬南芥黃酮類合成調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子編碼基因TTG1、PAP1, PAP2和TT2的同源基因,它們之間具有很高的相似性。4.通過數(shù)字基因表達(dá)譜分析百脈根黃酮類合成相關(guān)基因在花、果莢、葉和根等不同器官中的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵酶編碼基因和相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因在所測定的四種器官中表達(dá)水平不盡相同。WD40家族同源基因unigene322在四種器官中都能夠表達(dá)；ANR家族的unigene更傾向于在花、果莢及根中表達(dá),在葉片中表達(dá)量很低；ANS家族基因更傾向于在花、根和葉中表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：miR156 SPL Lotus japonicus L.corniculatus 過表達(dá) 根瘤菌共生 轉(zhuǎn)錄組 數(shù)字基因表達(dá)譜 類黃酮代謝
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S541.6;Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮寫7-12
• 第一章 引言12-31
• 1.1 Small RNA的研究進(jìn)展12
• 1.2 sRNA的發(fā)現(xiàn)及分類12-14
• 1.3 miRNA的生物發(fā)生過程及研究進(jìn)展14-17
• 1.4 miRNA在植物中的功能研究17-19
• 1.4.1 miRNA參與植物激素信號通路的調(diào)節(jié)17-18
• 1.4.2 miRNA在植物器官發(fā)育形成中的作用18-19
• 1.4.3 miRNA在植物中的其他生物學(xué)功能19
• 1.5 miR156及其靶基因SPL的功能研究進(jìn)展19-23
• 1.6 百脈根在生物學(xué)中的研究意義23-25
• 1.7 百脈根與根瘤菌共生的分子調(diào)控機制25-26
• 1.8 第二代測序技術(shù)26-27
• 1.9 植物體內(nèi)黃酮類化合物生物合成的研究及其意義27-29
• 1.10 本研究的目的、內(nèi)容和意義29-31
• 第二章 miR156在光葉百脈根中的功能研究31-73
• 2.1 材料和主要試劑31-33
• 2.1.1 植物材料31
• 2.1.2 宿主菌和質(zhì)粒載體31
• 2.1.3 主要試劑和溶液的配制31-33
• 2.1.4 主要儀器33
• 2.2 載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化33-51
• 2.2.1 LjmiR156α的分子克隆33-38
• 2.2.1.1 RNA的提取33-35
• 2.2.1.2 cDNA第一鏈的合成35
• 2.2.1.3 利用PCR克隆目標(biāo)基因35
• 2.2.1.4 PCR產(chǎn)物的回收35-36
• 2.2.1.5 回收片段與克隆載體的連接36-37
• 2.2.1.6 感受態(tài)細(xì)胞的制備及重組質(zhì)粒對大腸桿菌的轉(zhuǎn)化37-38
• 2.2.2 過表達(dá)載體的構(gòu)建38
• 2.2.3 含有過表達(dá)載體的農(nóng)桿菌的獲得38-39
• 2.2.3.1 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備38-39
• 2.2.3.2 農(nóng)桿菌的電轉(zhuǎn)化39
• 2.2.4 光葉百脈根的遺傳轉(zhuǎn)化39-41
• 2.2.5 轉(zhuǎn)基因光葉百脈根的篩選與鑒定41-45
• 2.2.5.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定41-42
• 2.2.5.2 轉(zhuǎn)基因株系的Southern印跡分析42-45
• 2.2.6 LjmiR156靶基因的篩選及鑒定45-48
• 2.2.6.1 LjmiR156靶基因的生物信息學(xué)篩選45-46
• 2.2.6.2 LjmiR156靶基因切割位點的驗證46-48
• 2.2.7 基因表達(dá)量的檢測48
• 2.2.8 原花青素的組織化學(xué)染色48
• 2.2.9 光葉百脈根與根瘤菌的共生48-50
• 2.2.10 根瘤發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)分析50-51
• 2.2.11 統(tǒng)計學(xué)分析51
• 2.3 結(jié)果與分析51-68
• 2.3.1 LjmiR156a的分子克隆及在光葉百脈根中的過表達(dá)51-54
• 2.3.2 過表達(dá)載體的構(gòu)建54-56
• 2.3.3 miR156過表達(dá)光葉百脈根的獲得56-57
• 2.3.4 miR156過表達(dá)光葉百脈根株系的Southern雜交驗證57-59
• 2.3.5 miR156過表達(dá)植株的表型特征59-61
• 2.3.6 光葉百脈根miR156靶基因的預(yù)測及檢驗61-65
• 2.3.6.1 光葉百脈根miR156潛在靶基因的預(yù)測分析61-62
• 2.3.6.2 Lj-miR156對靶基因的調(diào)控作用62-65
• 2.3.7 過表達(dá)miR156對光葉百脈根與根瘤菌共生的影響65-67
• 2.3.8 miR156可以影響黃酮類化合物的分布67-68
• 2.4 討論68-73
• 第三章 百脈根轉(zhuǎn)錄組及表達(dá)譜的測定73-87
• 3.1 實驗材料與方法73-76
• 3.1.1 實驗材料73
• 3.1.2 RNA的提取73
• 3.1.3 轉(zhuǎn)錄組測定73-74
• 3.1.4 數(shù)據(jù)分析74-76
• 3.2 百脈根轉(zhuǎn)錄組的分析76-84
• 3.2.1 測序結(jié)果分析76-77
• 3.2.2 百脈根轉(zhuǎn)錄組與光葉百脈根基因組的比較77-78
• 3.2.3 對拼接序列進(jìn)行基因功能注釋78-79
• 3.2.4 類黃酮合成代謝途徑相關(guān)基因79-83
• 3.2.5 百脈根轉(zhuǎn)錄組中的轉(zhuǎn)錄因子83-84
• 3.3 各器官基因的數(shù)字表達(dá)譜分析84-86
• 3.4 討論86-87
• 結(jié)論87-88
• 附錄88-91
• 附表1 論文中所使用的引物88-91
• 參考文獻(xiàn)91-102
• 攻讀博士學(xué)位期間取得的學(xué)術(shù)成果102-103
• 個人簡介103-104
• 致謝104

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本文編號：700269