本文關(guān)鍵詞：HDAC6緩解神經(jīng)毒性多肽誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡機(jī)制的研究

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【摘要】：傳染性海綿狀腦病又稱朊病毒病,是一種漸進(jìn)性、致死性的神經(jīng)退化性疾病,該類疾病的主要特征是腦組織海綿狀空泡化、神經(jīng)元死亡和膠質(zhì)細(xì)胞增多。該病的致病機(jī)理主要是由于正常細(xì)胞型朊蛋白(PrPc)發(fā)生錯(cuò)誤折疊轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒碗玫鞍?PrPSc)所導(dǎo)致的。自噬溶酶體途徑是降解錯(cuò)誤折疊的蛋白和損傷的線粒體來(lái)抵抗神經(jīng)退化的重要降解系統(tǒng),并且,有研究發(fā)現(xiàn)一些自噬的藥物增強(qiáng)劑能夠在體內(nèi)和體外促進(jìn)prpSc的清除。HDAC6是近年來(lái)在其他神經(jīng)退化性疾病中研究比較多的一種組蛋白脫乙酰酶,區(qū)別于其他組蛋白酶家族成員,它除了含有組蛋白脫乙酰酶結(jié)構(gòu)外還含有一個(gè)ZnF-UBP結(jié)構(gòu),這使得該蛋白可以結(jié)合泛素化的錯(cuò)誤折疊蛋白,這些結(jié)構(gòu)使得HDAC6具有多樣化的功能,近年來(lái)已經(jīng)成為研究神經(jīng)退化性疾病的發(fā)病機(jī)理和治療的靶點(diǎn)。本研究試圖探索HDAC6在Prion疾病中的功能,從而為研究Prion疾病的致病機(jī)理和治療提供新的研究思路。首先,本文研究了PrP106-126作用下的神經(jīng)元內(nèi)HDAC6的表達(dá)和定位以及HDAC6對(duì)于PrP106-126神經(jīng)毒性的影響。而后本文研究了在PrP106-126作用下,HDAC6對(duì)自噬及PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)PrP106-126改變HDAC6的表達(dá),促進(jìn)HDAC6轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核周圍,并且參與調(diào)節(jié)PrP106-126的神經(jīng)毒性；抑制HDAC6的脫乙酰酶活性或者RNA干擾降低HDAC6的表達(dá)能夠明顯地增加PrP106-126導(dǎo)致的神經(jīng)元死亡,而過(guò)表達(dá)HDAC6則可以減少PrP106-126造成的神經(jīng)元死亡,這表明HDAC6參與神經(jīng)元抵抗PrP106-126的神經(jīng)毒性。(2)研究發(fā)現(xiàn),自噬抑制劑3-MA和Bafilomycin Al可以阻止HDAC6的神經(jīng)保護(hù)作用,這表明HDAC6緩解PrP106-126誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡涉及自噬的參與；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在PrP106-126的作用下,過(guò)表達(dá)HDAC6可以增強(qiáng)神經(jīng)元的自噬流,而抑制HDAC6的活性或者shRNA干擾HDAC6的表達(dá)則會(huì)抑制神經(jīng)元的自噬。(3)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),在PrP106-126的作用下的原代神經(jīng)元中過(guò)表達(dá)HDAC6可以降低磷酸化mTORC1和磷酸化p70S6K；然而,RNA干擾HDAC6的表達(dá)則會(huì)增加磷酸化mTORC 1和磷酸化p70S6K。為了進(jìn)一步研究HDAC6對(duì)mTORC 1上游PI3K-Akt信號(hào)通路的影響,我們檢測(cè)了HDAC6對(duì)促生長(zhǎng)因子Akt的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HDAC6參與調(diào)節(jié)Akt的磷酸化,過(guò)表達(dá)HDAC6可以增加磷酸化的Akt,相反地,降低HDAC6的表達(dá)則導(dǎo)致磷酸化Akt的減少。細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果表明,PI3K-Akt的抑制劑Wortmanin也可以阻止HDAC6的神經(jīng)保護(hù)作用,而PI3K-Akt的激活劑IGF-1則可以明顯增加HDAC6干擾后的神經(jīng)元存活率,這表明HDAC6通過(guò)調(diào)節(jié)Akt的激活來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)機(jī)制的。綜上所述,本研究證明,HDAC6可以通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路來(lái)保護(hù)神經(jīng)元抵抗PrP106-126的神經(jīng)毒性；
【關(guān)鍵詞】：朊病毒病 PrP106-126 自噬 HDAC6 PI3K-Akt-mTOR
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.3
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• ABSTRACT5-11
• 英文縮寫(xiě)表11-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-33
• 1.1 傳染性海綿狀腦病的概述13-15
• 1.1.1 傳染性和海綿狀腦病的特征及分類13-14
• 1.1.2 TSEs的發(fā)展歷史14-15
• 1.2 朊蛋白的生理功能15-21
• 1.2.1 PrP~C的結(jié)構(gòu)15-16
• 1.2.2 PrP~C的生物學(xué)功能16-19
• 1.2.3 PrP~C向PrP~(Sc)的轉(zhuǎn)化機(jī)制19-21
• 1.3 感染機(jī)制21-23
• 1.3.1 朊病毒進(jìn)入體內(nèi)的方式21-22
• 1.3.2 朊病毒進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的途徑22-23
• 1.4 自噬在朊病毒中的作用23-28
• 1.4.1 自噬的分類及特點(diǎn)23-25
• 1.4.2 自噬的調(diào)節(jié)25-27
• 1.4.3 疾病相關(guān)的選擇性自噬27-28
• 1.5 HDAC6在神經(jīng)退化性疾病中的功能28-31
• 1.5.1 HDAC6作為脫乙酰酶的功能28-29
• 1.5.2 HDAC6在細(xì)胞應(yīng)對(duì)錯(cuò)誤折疊的聚集體蛋白中的作用29-31
• 1.5.3 HDAC6作為壓力存活因子31
• 1.6 朊蛋白的神經(jīng)毒性形式31
• 1.7 本研究的目的和意義31-33
• 第二章 HDAC6負(fù)調(diào)節(jié)PRP106-126誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡33-52
• 引言33
• 2.1 材料33-38
• 2.1.1 細(xì)胞33-34
• 2.1.2 主要試劑34-35
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)所用溶液的配制35-37
• 2.1.4 主要儀器及設(shè)備37-38
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法38-45
• 2.2.1 小鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元的分離培養(yǎng)38
• 2.2.2 HA-HDAC6重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建38-41
• 2.2.3 無(wú)內(nèi)毒素重組質(zhì)粒HDAC6-HA的大量提取41-42
• 2.2.4 HDAC6-HA的質(zhì)粒、shRNA-HDAC6的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)元42-43
• 2.2.5 PrP106-126刺激神經(jīng)元43
• 2.2.6 FITC-PrP106-126刺激神經(jīng)元43
• 2.2.7 PrP106-126與HDAC6的特異性抑制劑Tubacin共同作用神經(jīng)元43
• 2.2.8 HDAC6蛋白的檢測(cè)43-44
• 2.2.9 免疫熒光檢測(cè)HDAC6的定位44
• 2.2.10 細(xì)胞活力的檢測(cè)44-45
• 2.2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析45
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-50
• 2.3.1 小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的分離培養(yǎng)及鑒定45-46
• 2.3.2 小鼠HDAC6基因的PCR擴(kuò)增46
• 2.3.3 重組質(zhì)粒HDAC6-HA的鑒定46-47
• 2.3.4 PrP106-126改變神經(jīng)元內(nèi)HDAC6的表達(dá)47-48
• 2.3.5 PrP106-126與神經(jīng)元內(nèi)的HDAC6共定位48-49
• 2.3.6 HDAC6參與調(diào)節(jié)PrP106-126誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡49-50
• 2.4 分析與討論50-52
• 第三章 自噬在HDAC6負(fù)調(diào)節(jié)PRP106-126誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡中的作用52-63
• 引言52
• 3.1 材料52-56
• 3.1.1 小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的分離培養(yǎng)53
• 3.1.2 主要試劑53
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)所用溶液的配制53-56
• 3.1.4 主要儀器及設(shè)備56
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法56-59
• 3.2.1 HDAC6-HA的質(zhì)粒、shRNA-HDAC6的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)元56-57
• 3.2.2 PrP106-126刺激神經(jīng)元57
• 3.2.3 PrP106-126分別與自噬的激活劑和抑制劑共刺激神經(jīng)元57
• 3.2.4 細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ的檢測(cè)57-58
• 3.2.5 細(xì)胞活力檢測(cè)58
• 3.2.6 透射電鏡觀察PrP106-126作用過(guò)表達(dá)HDAC6的神經(jīng)元的自噬情況58
• 3.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析58-59
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果59-62
• 3.3.1 過(guò)表達(dá)HDAC6可以增強(qiáng)自噬59-60
• 3.3.2 抑制HDAC6的活性可以降低自噬60-61
• 3.3.3 透射電鏡觀察過(guò)表達(dá)HDAC6對(duì)神經(jīng)元自噬的影響61-62
• 3.4 分析與討論62-63
• 第四章 PI3K-AKT-MTOR信號(hào)通路在HDAC6負(fù)調(diào)節(jié)PRP106-126誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡中的作用63-76
• 引言63
• 4.1 材料63-67
• 4.1.1 小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的分離培養(yǎng)63
• 4.1.2 主要試劑63-64
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)所用溶液的配制64-66
• 4.1.4 主要儀器及設(shè)備66-67
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法67-70
• 4.2.1 HDAC6-HA的質(zhì)粒、shRNA-HDAC6的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)元67-68
• 4.2.2 PrP106-126刺激神經(jīng)元68
• 4.2.3 PrP106-126與Tubacin和PI3K-Akt抑制劑Wortmanin共刺激神經(jīng)元68
• 4.2.4 細(xì)胞內(nèi)Phospho-mTOR、Phspho-Akt、Phospho-70S6K的檢測(cè)68-69
• 4.2.5 免疫熒光檢測(cè)Phospho-Akt69
• 4.2.6 細(xì)胞活力檢測(cè)69-70
• 4.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析70
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果70-74
• 4.3.1 HDAC6通過(guò)抑制mTOR的活性來(lái)增強(qiáng)自噬70-71
• 4.3.2 過(guò)表達(dá)HDAC6可以激活A(yù)kt71-73
• 4.3.3 抑制HDAC6降低磷酸化的Akt73-74
• 4.4 分析與討論74-76
• 結(jié)論76-77
• 創(chuàng)新點(diǎn)77-78
• 參考文獻(xiàn)78-91
• 致謝91-92
• 個(gè)人簡(jiǎn)介92

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本文編號(hào)：685634