本文關(guān)鍵詞：鎘中毒及鋅對鎘中毒的作用機理研究

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【摘要】：鎘(Cadmium,Cd)是一種有毒的重金屬元素,可以造成人和動物多種器官或系統(tǒng)的毒性損傷。肝臟和腎臟是機體鎘中毒最主要的兩個靶器官。高濃度或者急性鎘中毒主要引起肝損傷;低濃度或慢性鎘中毒則主要造成腎損害。細胞水平上,鎘可以通過多種途徑誘導(dǎo)細胞凋亡。其中,鎘誘導(dǎo)的細胞ROS增加是引起細胞凋亡的重要原因之一。鎘能直接或間接引起細胞ROS過量產(chǎn)生,同時鎘持續(xù)消耗MT、GSH、SOD等細胞重要的抗氧化蛋白、酶,最終造成ROS在細胞內(nèi)短暫或持續(xù)性的累積。隨后細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化物反應(yīng),經(jīng)歷氧化損傷。氧化損傷進一步導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)完整性下降、線粒體等細胞器功能損害、染色體斷裂、功能蛋白失活等一系列后果,最終細胞發(fā)生不可恢復(fù)性損傷,走向凋亡。鋅(Zinc,Zn)是一種機體必需的微量元素,參與人體超過120多種酶的生物合成和300多種酶的功能調(diào)控。缺鋅會造成胎兒發(fā)育異常、免疫力下降、神經(jīng)紊亂、機體疾病發(fā)生和死亡率提高等一系列后果。近年來,人們發(fā)現(xiàn)鋅可以對抗包括重金屬在內(nèi)多種刺激引起的細胞毒性,起到解毒效果。鋅對細胞的保護作用涉及多種機制,其中,被廣泛研究的一種是鋅對細胞抗氧化能力的提高作用。鋅通過促進細胞內(nèi)還原性蛋白和抗氧化酶的表達,提高細胞的抗氧化能力,加速細胞對ROS的清除效率,對抗刺激源引起的細胞脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)和氧化性損傷,最終抑制細胞凋亡。金屬硫蛋白(MT)是一類富含半胱氨酸的低分子多肽,對維護細胞正常氧化還原狀態(tài)起著至關(guān)重要的作用。MT對細胞自由基具有強大的清除能力,能及時清理細胞新陳代謝過程中產(chǎn)生的ROS。鋅是MT生理狀態(tài)下結(jié)合的主要金屬元素,同時也是MT細胞表達的重要誘導(dǎo)物。鋅對MT的調(diào)控依賴金屬結(jié)合原件(MTF-1)的參與。鋅通過與MTF-1結(jié)合,激活MTF-1蛋白活性�；罨腗TF-1向細胞核移動,與位于MT轉(zhuǎn)錄基因上游的金屬反應(yīng)應(yīng)答原件(MRE)識別并結(jié)合,開啟MT基因轉(zhuǎn)錄程序。20世紀60年代起,人們陸續(xù)建立了鼠、兔、豬、猴、魚等多種鎘中毒模型,從不同角度研究鎘中毒機理。近年來,有人通過向鎘中毒模型中添加鋅劑的方法,研究鋅對鎘中毒的解毒效果和作用機理。然而,作為一種外源性物質(zhì),不同劑量的鋅添加會對機體和細胞產(chǎn)生不同的作用效果,而且不同的種屬和器官對鋅的耐受力也存在著很大的差異。所以鋅在鎘中毒過程中的作用尚不完全清楚,且備受爭議。本試驗在參考前人研究成果基礎(chǔ)上,運用金屬組學(xué)方法,通過以下幾個方面對鎘中毒以及鋅對鎘中毒的作用機理展開研究。1.慢性鎘中毒對小鼠肝、腎中MT基因、蛋白表達的影響連續(xù)21天對昆明小鼠腹腔注射1 mg/kg體重的Cd Cl2(Cd2+計)。第22天時一次性犧牲小鼠,摘取小鼠肝、腎。提取各組小鼠肝、腎的RNA和蛋白,熒光定量PCR和雙抗夾心ELISA法分別檢測肝、腎MT基因和蛋白的表達水平。結(jié)果顯示,與對照組相比,鎘攻毒組小鼠肝臟MT-1和MT-2 m RNA轉(zhuǎn)錄水平均顯著提高(P0.01),分別上升7.7和10倍。鎘攻毒同時引起小鼠腎臟MT基因表達量的顯著增加。但與肝臟不同,鎘攻毒組小鼠腎臟MT-1 m RNA的轉(zhuǎn)錄水平(P0.01)高于MT-2 m RNA(P0.05),表達量約為MT-2 m RNA的2倍。免疫組化結(jié)果顯示,MT蛋白在肝細胞胞質(zhì)中均勻分布,在腎臟近曲小管和部分遠曲小管細胞質(zhì)中存在明顯。雙抗夾心ELISA法進一步檢測肝、腎中MT蛋白含量。對比正常組小鼠,鎘攻毒組小鼠肝臟中MT蛋白含量增加,差異極顯著(P0.01);而腎臟MT蛋白攻毒前后水平趨于穩(wěn)定,差異不顯著(P0.05)。這一結(jié)果可能與Cd-MT在腎臟的分解和代謝平衡有關(guān)。但無論試驗組或?qū)φ战M,腎臟中MT蛋白總量均高于肝臟。2.慢性鎘中毒對小鼠肝、腎中金屬元素代謝的影響與對照組小鼠相比,鎘攻毒組小鼠肝、腎組織中鎘離子含量均大幅增加(P0.01),且鎘離子在肝臟中的積累是腎臟的2倍多。伴隨著鎘離子在小鼠器官中的聚集,試驗組小鼠肝、腎中鋅離子含量也明顯增加,分別達到66.04μg/g(P0.01)和35.33μg/g(P0.05)。與鋅離子的變化趨勢相反,試驗組小鼠腎臟鈣離子含量顯著上升(P0.01),達到700μg/g體重,而在肝臟中鈣離子含量出現(xiàn)明顯降低。鐵離子變化趨勢與鈣離子相同,在試驗組小鼠腎臟中含量顯著增加(P0.01),而在肝臟中有所降低。慢性鎘攻毒后,銅離子含量在肝臟中顯著增加(P0.01);在腎臟中也有上升,但差異不顯著。3.鎘對牛腎上皮細胞的毒性損傷前期試驗結(jié)果表明鎘中毒能引起肝、腎組織對鋅離子吸收的增加。為了進一步探討鎘毒性損傷以及鋅在鎘中毒過程中發(fā)揮的作用,本試驗采用體外研究模式,對牛腎上皮細胞系(MDBK)進行鎘攻毒,觀察24 h內(nèi)鎘對MDBK細胞的毒性損傷,并通過向細胞培養(yǎng)液中添加Zn Cl2的方式,探討鋅添加對鎘細胞毒性的作用效果及其原理。試驗結(jié)果顯示,單獨鎘攻毒造成MDBK細胞時間-濃度依賴性細胞凋亡。鎘攻毒導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)破壞、骨架蛋白降解、細胞ROS含量聚集、線粒體膜電位下降等一系列毒性損傷。10μM鎘處理引起細胞輕度損傷,細胞ROS隨攻毒時間的延長持續(xù)積累,線粒體膜電位不斷下降,部分細胞發(fā)生凋亡。50μM鎘攻毒造成ROS在短時間內(nèi)在細胞內(nèi)的快速累積,線粒體損傷嚴重,大部分細胞經(jīng)歷不可恢復(fù)性損傷,細胞凋亡率大幅增加。4.鋅添加對鎘致牛腎上皮細胞毒性的影響試驗向鎘攻毒細胞培養(yǎng)液中加入不同濃度Zn Cl2,研究鋅對鎘細胞毒性的作用效果。結(jié)果表明,鋅添加能顯著降低鎘中毒引起的細胞凋亡,對細胞產(chǎn)生明顯的保護作用。試驗同時發(fā)現(xiàn)鋅對鎘中毒的抑制作用是有條件的。輕度鎘中毒(10μM)下,鋅添加能顯著降低鎘中毒導(dǎo)致的細胞ROS過量產(chǎn)生,恢復(fù)線粒體膜電位水平以及細胞結(jié)構(gòu)完整性,從而減少細胞凋亡,對抗鎘毒性。鋅添加對輕度鎘中毒的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性。提高細胞液鋅離子添加量(50μM)能顯著增強鋅對細胞的保護作用,對鎘毒性的對抗作用更明顯。然而,鋅的濃度依賴性細胞保護作用只在輕度鎘中毒情況下效果明顯,對重度鎘中毒造成的損傷抑制作用并不顯著。細胞遭受高濃度鎘攻毒后(50μM),鋅添加只能減小鎘攻毒前期(12 h)引起的細胞損傷,在一定程度上降低細胞ROS的產(chǎn)生,恢復(fù)線粒體膜電位水平。在重度鎘攻毒后期(12 h),鋅添加對鎘損傷的抑制作用不明顯,甚至起到加劇鎘細胞毒性的作用。這可能是因為長時間的高濃度鎘攻毒導(dǎo)致細胞發(fā)生不可恢復(fù)性損傷,添加鋅不但無法改善細胞功能或相關(guān)蛋白的活性,相反會成為額外刺激,引起細胞的二次損傷。5.鎘、鋅單獨或聯(lián)合處理對牛腎上皮細胞MTF-1、MT表達水平的影響鎘、鋅單獨處理MDBK細胞0-24 h,MT-1/2 m RNA轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)不同程度的上升。向鎘攻毒細胞液中添加鋅,MT-1和MT-2基因的表達水平進一步提高。這提示鎘或鋅都能促進MDBK細胞MT基因的表達,而鋅添加可以通過進一步提高鎘攻毒細胞中MT基因的表達量來發(fā)揮作用。另外,單獨鎘、鋅處理均能引起MDBK細胞MTF-1基因不同程度的表達增加;向鎘攻毒細胞液中添加鋅,MTF-1基因的表達水平出現(xiàn)進一步的上升,這提示鋅對MT基因的調(diào)控可能與MTF-1表達量的增加有關(guān)。蛋白免疫印跡分析表明,單獨鎘、鋅處理均能引起MDBK細胞MTF-1、MT蛋白時間-濃度依賴性表達增強。對鎘攻毒細胞進行鋅補充,細胞MTF-1、MT蛋白合成量繼續(xù)上升,且這種趨勢也具有時間-濃度依賴性。蛋白分析結(jié)果與基因檢測結(jié)果趨勢相吻合。試驗還通過對MTF-1、MT蛋白進行免疫熒光檢測,從蛋白細胞分布強度上驗證了以上結(jié)果。6.鋅添加對鎘攻毒細胞Cd2+、Zn2+吸收作用的影響試驗采用電感耦合等離子質(zhì)譜法(ICP-MS)測定鎘、鋅單獨或聯(lián)合處理過程中細胞內(nèi)Cd2+和Zn2+的含量,研究鋅添加是否能影響細胞對鎘的吸收。結(jié)果顯示,鋅對低濃度鎘(10μM)引起的細胞內(nèi)Cd2+聚集具有顯著的濃度依賴性抑制作用,且這一過程伴隨著細胞內(nèi)Zn2+含量的增加。而面對高濃度鎘(50μM)攻毒,鋅對細胞Cd2+吸收的抑制作用并不明顯,甚至高劑量鋅添加(50μM)會加重Cd2+在細胞內(nèi)的沉積。以上結(jié)果表明,鋅可以阻止鎘攻毒過程中細胞對Cd2+的吸收,產(chǎn)生細胞保護作用。但鋅這一影響的實現(xiàn)是有條件的,即鋅對細胞Cd2+的吸收抑制在輕度鎘攻毒模式下效果顯著,在重度鎘中毒過程中并不明顯。
【關(guān)鍵詞】：鎘 鋅 細胞凋亡 金屬硫蛋白 金屬反應(yīng)結(jié)合蛋白 ROS 線粒體
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S856.9
【目錄】：

• 摘要8-12
• Abstract12-16
• 縮略詞表16-18
• 第一部分 文獻綜述18-51
• 第一章 鎘中毒相關(guān)研究進展18-45
• 引言18
• 1.1 鎘的理化性質(zhì)18-19
• 1.2 鎘污染19-21
• 1.3 鎘吸收與代謝21-22
• 1.4 鎘毒性與損傷22-28
• 1.4.1 鎘與肝損傷22-23
• 1.4.2 鎘與腎損傷23-24
• 1.4.3 鎘與骨損傷24-25
• 1.4.5 鎘與神經(jīng)損傷25-26
• 1.4.6 鎘與呼吸系統(tǒng)損傷26-27
• 1.4.7 鎘與心血管系統(tǒng)損傷27-28
• 1.5 鎘中毒早期監(jiān)測指標28-29
• 1.6 鎘中毒預(yù)防與治療29-30
• 1.7 鎘中毒機理研究進展30-45
• 1.7.1 鎘與氧化損傷30-32
• 1.7.2 鎘與線粒體32-33
• 1.7.3 鎘與 第二信使‖33-34
• 1.7.4 鎘與神經(jīng)酰胺34-35
• 1.7.5 鎘與Ca2+35-36
• 1.7.6 鎘與鈣蛋白酶36-37
• 1.7.7 鎘與p5337-38
• 1.7.8 鎘與癌癥38
• 1.7.9 鎘與DNA損傷38-40
• 1.7.10 鎘與信號通路40-45
• 第二章 鋅細胞作用研究進展45-51
• 2.1 鋅的吸收與代謝45-46
• 2.2 鋅的細胞功能46-51
• 2.2.1 鋅缺乏46-47
• 2.2.2 鋅補充47-48
• 2.2.3 鋅中毒48
• 2.2.5 鋅與MT48-51
• 第二部分 試驗研究51-98
• 第三章 慢性鎘中毒對小鼠肝腎的毒性損害研究51-68
• 摘要51-52
• Abstract52-53
• 3.1 研究背景53
• 3.2 材料與方法53-60
• 3.2.1 試驗動物53
• 3.2.2 儀器設(shè)備53-54
• 3.2.3 主要試驗試劑54-55
• 3.2.4 動物處理55
• 3.2.5 MT-1/2 基因Real-time PCR檢測55-57
• 3.2.6 MT蛋白免疫組化57-58
• 3.2.7 MT蛋白ELISA法濃度檢測58-59
• 3.2.8 肝、腎金屬元素含量檢測59-60
• 3.2.9 數(shù)據(jù)分析60
• 3.3 結(jié)果60-65
• 3.3.1 小鼠體重分析60
• 3.3.2 慢性鎘中毒小鼠肝、腎中MT基因轉(zhuǎn)錄水平60-62
• 3.3.3 慢性鎘中毒小鼠肝、腎中MT蛋白免疫組化62-63
• 3.3.4 慢性鎘中毒小鼠肝、腎中MT蛋白濃度檢測63-64
• 3.3.5 慢性鎘中毒小鼠肝、腎中金屬離子濃度64-65
• 3.4 討論65-68
• 第四章 鎘致牛腎上皮細胞毒性損傷及鋅對鎘中毒作用機理研究68-98
• 摘要68-69
• Abstract69-70
• 4.1 研究背景70
• 4.2 材料與方法70-82
• 4.2.1 試驗動物70-71
• 4.2.2 儀器設(shè)備71
• 4.2.3 主要試驗試劑71-73
• 4.2.4 細胞培養(yǎng)與鎘、鋅處理73
• 4.2.5 細胞形態(tài)學(xué)觀察73-74
• 4.2.6 細胞骨架熒光染色74
• 4.2.7 細胞AO/EB染色74
• 4.2.8 細胞凋亡檢測74-75
• 4.2.9 細胞ROS水平檢測75-76
• 4.2.10 細胞線粒體膜電位(MMP)水平檢測76-77
• 4.2.11 Real-time PCR檢測77-78
• 4.2.12 細胞免疫熒光染色78-79
• 4.2.13 蛋白免疫印跡分析79-81
• 4.2.14 細胞內(nèi)金屬元素含量分析81
• 4.2.15 數(shù)據(jù)分析81-82
• 4.3 結(jié)果82-95
• 4.3.1 細胞形態(tài)觀察82
• 4.3.2 細胞骨架蛋白染色82-83
• 4.3.3 細胞AO/EB染色83-84
• 4.3.4 鋅對鎘攻毒細胞凋亡的影響84-86
• 4.3.5 鋅對鎘攻毒細胞ROS產(chǎn)生的影響86-88
• 4.3.6 鋅對鎘攻毒細胞MMP的影響88-89
• 4.3.7 細胞MTF-1、MT-1/2 基因表達水平檢測89-91
• 4.3.8 細胞MTF-1、MT蛋白免疫熒光檢測91-92
• 4.3.9 細胞MTF-1、MT蛋白免疫印跡92-93
• 4.3.10 鎘、鋅處理細胞內(nèi)Cd2+、Zn2+含量測定93-95
• 4.4 討論95-98
• 4.4.1 鎘對MDBK的細胞毒性95
• 4.4.2 鋅對鎘細胞毒性的抑制作用95-97
• 4.4.3 鋅對鎘細胞毒性抑制作用的局限性97-98
• 全文結(jié)論98-99
• 參考文獻99-122
• 致謝122-123
• 附錄123-124

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 楊靖輝,常林,唐朝樞;金屬硫蛋白——心血管細胞保護劑[J];北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2002年05期

2 梁弟;鎘對機體毒性作用機制國內(nèi)研究進展[J];職業(yè)與健康;2002年01期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 劉穎;氯化鎘誘導(dǎo)HL-7702細胞凋亡及其機制的研究[D];吉林大學(xué);2006年

2 劉愛華;p53和p38對UV誘導(dǎo)的細胞凋亡的抑制效應(yīng)及其機制研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2007年

3 杜文靜;p53蛋白在細胞凋亡中的作用機制研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 彭西;雛鴨鋅缺乏及鋅中毒的病理學(xué)研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

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本文編號：672204