本文關(guān)鍵詞：遼寧地區(qū)歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法建立與流行情況調(diào)查

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【摘要】：豬繁殖與呼吸綜合征在世界各地廣泛流行,對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。近年來國內(nèi)豬群中不斷檢測到歐洲型PRRSV,而且歐洲型毒株感染有上升趨勢。歐洲型病毒株的感染不但可以引起豬只死亡,也能引起免疫抑制,同時還影響高致病性豬藍耳病的防控工作。本論文以自然發(fā)病病例為基礎(chǔ),從病原學、病理學和分子生物學等多方面進行診斷方法的研究,并對分離毒株進行全基因測序,分析遺傳變異特點,在此基礎(chǔ)上建立PRRSV多重PCR鑒別診斷方法及間接ELISA檢測方法,對遼寧地區(qū)開展歐洲型PRRSV流行情況調(diào)查,分析了發(fā)病原因并提出防控建議。用Marc-145細胞從疑似PRRS仔豬病料中分離到一株病毒,經(jīng)電鏡觀察、中和試驗、PCR鑒定和基因序列分析確定為歐洲型PRRSV(命名為LNEU12);通過仔豬感染試驗對歐洲型PRRS的臨診表現(xiàn)、病理變化特點和病毒抗原在組織分布情況進行了全面的研究,初步建立了歐洲型PRRS的診斷方法,并證實遼寧地區(qū)存在歐洲型PRRSV。采用RT-PCR方法對遼寧分離株LNEU12的全基因序列進行分段擴增,并進行了序列分析。LNEU12毒株基因全長15083bp(不含尾部),Gen Bank登陸號為KM196101(已公布)。LNEU12毒株有8個開放閱讀框,與國內(nèi)外14株歐洲型PRRSV的核苷酸同源性為83.7%~93.0%,其中與歐洲型標準毒株LV同源性為90.1%,而與美洲型標準毒株VR2332株同源性僅為59.6%。與歐洲型標準毒株LV比較缺失了18個核苷酸,在NSP2氨基酸的358~359和409位點分別缺失了4個和1個氨基酸,在ORF3、ORF4基因重疊區(qū)域缺失了3個堿基。針對歐洲型毒株ORF7和美洲型毒株NSP2基因序列用Oligo 7.0軟件設計2對特異性引物建立了多重PCR檢測方法,該方法可以特異性擴增出歐洲型毒株、美洲型經(jīng)典毒株和變異毒株的目的基因,片段大小差異在90bp以上便于電泳觀察,重組質(zhì)粒標準品檢測下限為1.93×103拷貝。用重疊延伸PCR將歐洲型PRRSV N蛋白特異性線性抗原A、C位點的基因進行重復串聯(lián),合成186bp的DNA基因片段。采用原核表達系統(tǒng)將串聯(lián)基因序列高效表達,獲得32.8k D的重組蛋白(含GST標簽),經(jīng)Western-blot檢測,該重組蛋白能與歐洲型PRRS陽性血清發(fā)生免疫反應,并且具有較高的特異性。用純化后的重組蛋白包被酶標板,建立了特異性檢測歐洲型PRRSV抗體的間接ELISA方法,該方法可以有效區(qū)別美洲型、歐洲型毒株的中和抗體。用建立的間接ELISA方法對遼寧地區(qū)歐洲型PRRSV進行血清學調(diào)查,結(jié)果顯示個體抗體陽性率為0.51%,豬場抗體陽性率為4.55%;用多重PCR方法對57個豬場271份疑似病料進行PRRSV病原調(diào)查,美洲型變異毒株檢出率為12.55%,經(jīng)典毒株檢出率為1.11%,歐洲型毒株檢出率為為2.21%。以上結(jié)果顯示,遼寧地區(qū)PRRSV的流行是以美洲型變異毒株為主,同時存在歐洲型毒株和美洲型經(jīng)典毒株,歐、美毒株共存已成為遼寧地區(qū)PRRSV流行的新特點。根據(jù)分離毒株相關(guān)基因同源性比較分析,推測遼寧流行的歐洲型病毒株可能是由引種或豬只流動時帶入的,并發(fā)生了一定變異而出現(xiàn)的歐洲型PRRSV變異毒株。根據(jù)遼寧地區(qū)歐洲型PRRS的流行特點,提出了該病的綜合防控措施,為遼寧地區(qū)歐洲型PRRS的凈化、預防和控制提供了參考建議。
【關(guān)鍵詞】：豬繁殖與呼吸綜合征 歐洲型 診斷 方法建立 流行情況調(diào)查 遼寧地區(qū)
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S858.28
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 英文縮略詞表12-14
• 引言14-16
• 第一篇 文獻綜述16-44
• 第1章 豬繁殖與呼吸綜合征的研究進展16-36
• 1.1 PRRS發(fā)病歷史16-17
• 1.2 PRRSV的生物學特征17-18
• 1.3 病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能研究18-23
• 1.4 PRRSV的基因組遺傳變異特點23-26
• 1.5 PRRS的流行病學特征26-28
• 1.6 發(fā)病機制28-31
• 1.7 PRRS的臨床癥狀31-32
• 1.8 PRRS的病理變化32-33
• 1.9 PRRS免疫學特點33-35
• 1.10 PRRS的綜合防控現(xiàn)狀與展望35-36
• 第2章 豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法的研究進展36-44
• 2.1 病毒分離36
• 2.2 病毒抗原的檢測技術(shù)36-37
• 2.3 PRRS病毒基因檢測37-39
• 2.4 抗體檢測技術(shù)39-41
• 2.5 其他檢測方法41-44
• 第二篇 研究內(nèi)容44-108
• 第3章 歐洲型PRRS病原學診斷研究44-58
• 3.1 材料與方法44-49
• 3.2 結(jié)果49-55
• 3.3 討論55-56
• 3.4 小結(jié)56-58
• 第4章 歐洲型PRRS病理形態(tài)學研究58-66
• 4.1 材料與方法58-60
• 4.2 結(jié)果60-64
• 4.3 討論64-65
• 4.4 小結(jié)65-66
• 第5章 歐洲型PRRSV遼寧分離株全基因測序與遺傳進化分析66-78
• 5.1 材料與方法66-68
• 5.2 結(jié)果68-74
• 5.3 討論74-75
• 5.4 小結(jié)75-78
• 第6章 歐洲型、美洲型PRRSV鑒別診斷方法的建立78-86
• 6.1 材料與方法78-81
• 6.2 結(jié)果81-84
• 6.3 討論84-85
• 6.4 小結(jié)85-86
• 第7章 基于N蛋白特異性抗原表位ELISA檢測方法的建立86-98
• 7.1 材料與方法86-91
• 7.2 結(jié)果91-96
• 7.3 討論96-97
• 7.4 小結(jié)97-98
• 第8章 遼寧地區(qū)歐洲型PRRSV流行情況調(diào)查及病因分析98-108
• 8.1 材料與方法98-100
• 8.2 結(jié)果100-103
• 8.3 討論103-107
• 8.4 小結(jié)107-108
• 結(jié)論108-110
• 參考文獻110-132
• 攻讀博士期間取得的主要科研成果132-134
• 導師簡介134-136
• 作者簡介136-138
• 致謝138

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