本文關(guān)鍵詞：雪柑實(shí)生苗生理生化及基因和microRNA表達(dá)對(duì)缺硼的響應(yīng)

  更多相關(guān)文章： 缺硼 雪柑 碳水化合物 microRNA cDNA-AFLP Illumina測(cè)序 生理生化

【摘要】：柑橘為亞熱熱帶果樹(shù),土壤淋溶、硼(B)固定、氮磷鈣施用不協(xié)調(diào)及氣候等原因致使我國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)常出現(xiàn)不同程度的缺硼現(xiàn)象。本研究以缺硼(0μM H3BO3)和對(duì)照(10μM H3BO3)處理15周的雪柑實(shí)生苗為試驗(yàn)材料,通過(guò)沙培試驗(yàn)研究了(1)缺硼對(duì)雪柑實(shí)生苗生長(zhǎng)和根葉生理生化的影響,(2)缺硼脅迫下雪柑根和葉基因的差異表達(dá),(3)缺硼脅迫下雪柑根和葉miRNA差異表達(dá),旨在從生理生化和分子水平闡明柑橘耐缺硼的機(jī)制,為柑橘高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供科學(xué)依據(jù)。1缺硼對(duì)雪柑實(shí)生苗生長(zhǎng)的影響在10 μM H3BO3處理下,雪柑實(shí)生苗生長(zhǎng)正常,不顯示任何缺硼癥狀,葉片的硼含量介于柑橘葉片硼足夠范圍(30-100μg g-1 DW),而0 μM B處理降低植株根莖葉干重(DW)及根葉硼含量；0 μMB處理葉片中的硼濃度遠(yuǎn)低于柑橘葉片足夠硼的范圍,且0 μMB處理雪柑葉片顯示出典型的缺硼癥狀,基于這些結(jié)果,0μM B處理被認(rèn)為缺硼,10 μM B處理被認(rèn)為硼充足(對(duì)照)。2缺硼對(duì)雪柑根葉生理生化的影響處理15周后,研究缺硼對(duì)氣體交換,碳水化合物、有機(jī)酸、氨基酸、可溶性總蛋白、總酚含量及有機(jī)酸和氨基酸代謝過(guò)程中相關(guān)酶活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)缺硼葉片有較多的碳水化合物和較低的CO2同化,可能是碳水化合物對(duì)光合作用的反饋抑制作用。缺硼提高了葉片呼吸速率、大部分有機(jī)酸(蘋(píng)果酸、檸檬酸、草酰乙酸、丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸)含量及參與糖酵解、三羧酸(TCA)循環(huán)、回補(bǔ)途徑的酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NAD-蘋(píng)果酸脫氫酶、NAD-蘋(píng)果酸酶、NADP-蘋(píng)果酸酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶、檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、NADP-異檸檬酸脫氫酶和己糖激酶)活性�？傆坞x氨基酸含量和相關(guān)代謝酶(NADH-谷氨酸2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶)活性在缺硼葉片中也增強(qiáng)。反之,呼吸速率、非結(jié)構(gòu)碳水化合物、有機(jī)酸(蘋(píng)果酸、檸檬酸、丙酮酸)及氨基酸含量在缺硼根系中減少,參與糖酵解、TCA循環(huán)、回補(bǔ)途徑的大部分代謝酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NADP-蘋(píng)果酸酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶、檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、NAD-異檸檬酸脫氫酶、NADP-異檸檬酸脫氫酶和己糖激酶]和氨基酸代謝酶(硝酸還原酶、NADH-谷氨酸2-酮戊二酸轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶和谷氨酰胺合成酶]活性也相應(yīng)降低。但是根系和葉片中的總酚(可溶性總蛋白)含量均增加(降低)�？傊�,呼吸作用、有機(jī)酸代謝、回補(bǔ)途徑和氨基酸合成在非結(jié)構(gòu)碳水化合物累積的缺硼葉片中增強(qiáng),以消耗過(guò)量的碳源,在根系中降低以保持碳平衡。3雪柑根葉缺硼響應(yīng)基因分離與鑒定應(yīng)用cDNA-AFLP,從缺硼葉片(根系)中分別分離出了54(38)個(gè)基因表達(dá)上調(diào),和38(45)個(gè)基因下調(diào)表達(dá),這些差異基因功能主要涉及蛋白和氨基酸代謝、碳水化合物和能量代謝、核酸代謝、細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境響應(yīng)。這些基因中大部分都是只從根系或葉片中分離獲得,只有7個(gè)(XP 006484536.1、XP_006488862.1、XP_007042812.1、XP_007043058.1、NP_564354.1、XP_006492455.1和BAF01964.1)相同的基因在根系和葉片中具有相同的基因庫(kù)注釋ID號(hào),其中有三個(gè)(XP_006484536.1、NP_564354.1和XP 006492455.1)基因在根葉中的表達(dá)趨勢(shì)一致以響應(yīng)缺硼脅迫。顯然,缺硼脅迫下根系和葉片中的基因表達(dá)呈現(xiàn)出巨大的差異性。比如：UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glycosyltransferases, UGTs)的表達(dá)在缺硼根系中上調(diào),在缺硼葉片中被下調(diào)；然而,ATP合成酶在前者被上調(diào),但在后者不受影響。所有參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的缺硼響應(yīng)基因在根系中被下調(diào),但在缺硼葉片中,除一個(gè)基因外,其余差異基因均被上調(diào)。在缺硼葉片中,除一個(gè)基因外,所有與泛素化和蛋白水解有關(guān)的基因均被誘導(dǎo)；然而在缺硼根系中,僅發(fā)現(xiàn)了二個(gè)與泛素化有關(guān)基因的表達(dá)被下調(diào)。參與逆境防御的基因在缺硼根系中被下調(diào),但在缺硼葉片中除一個(gè)基因外,其余差異基因表達(dá)均被上調(diào)。4雪柑根系缺硼響應(yīng)microRNAs分離及鑒定通過(guò)Illumina測(cè)序,本研究從缺硼根系中分離了52個(gè)(40個(gè)保守和12個(gè)未知)上調(diào)表達(dá)的和82個(gè)(72個(gè)保守和10個(gè)未知)下調(diào)表達(dá)的miRNAs,表明了根系具有巨大的代謝靈活性,這可能有助于植株的耐缺硼性。MiRNAs可能通過(guò)以下幾個(gè)方面來(lái)調(diào)節(jié)根系對(duì)缺硼的適應(yīng)性：(a)上調(diào)miR474表達(dá),下調(diào)miR782和miR843表達(dá),激活防御反應(yīng)、ROS信號(hào)和清除；(6)降低miR5023以增加側(cè)根數(shù)量,增強(qiáng)miR394表達(dá)量以保持有利于缺硼適應(yīng)的表型；(c)降低miR830、 miR5266和miR3465表達(dá),增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)輸；(d)改善滲透調(diào)節(jié)(miR474),調(diào)節(jié)其它代謝反應(yīng)(miR5023和miR821)；(e)增強(qiáng)根系中miR472和miR2118表達(dá),降低與疾病抵抗相關(guān)靶基因表達(dá),從而降低根系的抗病性。5雪柑葉片缺硼響應(yīng)microRNAs分離及鑒定通過(guò)Illumina測(cè)序,本研究從缺硼和正常供硼葉片中各分離出91個(gè)(83個(gè)保守和8個(gè)未知)上調(diào)表達(dá)的和81個(gè)(75個(gè)保守和6個(gè)未知)下調(diào)表達(dá)的miRNAs,表明了缺硼大大地改變了niRNAs表達(dá),這可能有利于柑橘對(duì)缺硼的適應(yīng)性。葉片miRNAs對(duì)缺硼的適應(yīng)性可能主要有以下幾個(gè)方面：(a)通過(guò)改變miR393、miR160和miR3946的表達(dá),降低TIR1水平和ARF介導(dǎo)的基因表達(dá),從而抑制生長(zhǎng)素信號(hào),弱化植株生長(zhǎng)和發(fā)育,因而增強(qiáng)植物脅迫耐受性；(6)下調(diào)miR159、miR782、miR3946和miR7539,上調(diào)MYBs表達(dá),維持適宜的葉片表型,增強(qiáng)植物脅迫抵抗能力；(c)下調(diào)miR164、miR6260、miR5929、 miR6214、miR3946和miR3446轉(zhuǎn)錄水平,活化脅迫響應(yīng)和抗氧化系統(tǒng)；(d)增強(qiáng)miR5037表達(dá),降低主要協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(MFS)基因轉(zhuǎn)錄水平,從而減弱硼從植物運(yùn)出；(e)下調(diào)miR408,調(diào)節(jié)銅平衡、增強(qiáng)超氧化物岐化酶(SOD)活性,參與植物耐缺硼抗性。
【關(guān)鍵詞】：缺硼 雪柑 碳水化合物 microRNA cDNA-AFLP Illumina測(cè)序 生理生化
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S666.1
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-32
• 1 土壤中硼營(yíng)養(yǎng)概述13-14
• 2 植物的硼營(yíng)養(yǎng)概述14-22
• 2.1 硼在植物中的分布與含量14
• 2.2 硼對(duì)植物生長(zhǎng)的影響14-16
• 2.3 缺硼脅迫下植物的生理響應(yīng)16-20
• 2.4 柑橘缺硼研究進(jìn)展20-21
• 2.5 植物耐缺硼的分子機(jī)理21-22
• 3 植物中的miRNA研究進(jìn)展22-28
• 3.1 植物miRNA的形成和作用機(jī)制23-24
• 3.2 植物miRNA功能24-27
• 3.3 植物miRNA的研究方法27-28
• 4 cDNA-AFLP技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展28-30
• 5 立題意義30
• 6 研究?jī)?nèi)容及技術(shù)路線30-32
• 6.1 研究?jī)?nèi)容30-31
• 6.2 技術(shù)路線31-32
• 第二章 缺硼對(duì)雪柑實(shí)生苗主要生理生化代謝的影響32-48
• 1 材料與方法33-35
• 1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)與硼處理33
• 1.2 生物量的測(cè)定33
• 1.3 根系、葉片硼含量的測(cè)定33-34
• 1.4 葉片光合作用和根系、葉片呼吸速率的測(cè)定34
• 1.5 根系和葉片有機(jī)酸含量測(cè)定方法34
• 1.6 有機(jī)酸相關(guān)代謝酶活性測(cè)定34
• 1.7 總酚、可溶性總蛋白和總游離氨基酸的測(cè)定34
• 1.8 根系和葉片中氨基酸代謝關(guān)鍵酶的測(cè)定34-35
• 1.9 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析35
• 2 結(jié)果與分析35-45
• 2.1 生物量和根葉硼含量35-36
• 2.2 葉片和根系氣體交換36
• 2.3 根葉中主要代謝產(chǎn)物的含量和關(guān)鍵酶的活性36-45
• 3 討論45-47
• 3.1 非結(jié)構(gòu)性碳水化合物在缺硼葉片中增加,在缺硼根系中減少45
• 3.2 缺硼導(dǎo)致雪柑葉片呼吸、有機(jī)酸代謝和回補(bǔ)途徑上調(diào),而在根系中下調(diào)45-46
• 3.3 缺硼下,根系氨基酸合成下調(diào),葉片氨基酸合成則上調(diào)46
• 3.4 缺硼增加根系和葉片酚類物質(zhì)累積46-47
• 4 小結(jié)47-48
• 第三章 缺硼脅迫下雪柑根葉cDNA-AFLP分析48-76
• 1 材料與方法48-52
• 1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)與硼處理48-49
• 1.2 植株生物量、根系和葉片硼含量的測(cè)定49
• 1.3 RNA的提取與檢測(cè)49
• 1.4 cDNA的合成49
• 1.5 cDNA的酶切及連接49
• 1.6 預(yù)擴(kuò)增及選擇性擴(kuò)增49-50
• 1.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳50
• 1.8 差異片段的回收、測(cè)序及比對(duì)50-51
• 1.9 差異片段的熒光定量PCR驗(yàn)證51
• 1.10 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和統(tǒng)計(jì)分析51-52
• 2 結(jié)果與分析52-63
• 2.1 缺硼對(duì)雪柑營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、根葉中B含量影響52-53
• 2.2 缺硼雪柑根葉基因表達(dá)差異53-54
• 2.3 根系和葉片中差異表達(dá)基因功能分析54-62
• 2.4 cDNA-AFLP熒光定量驗(yàn)證62-63
• 3 討論63-72
• 3.1 缺硼相關(guān)基因在柑橘根系、葉片中的差異63
• 3.2 參與碳水化合物和能量代謝的基因63-64
• 3.3 參與核酸代謝的基因64-66
• 3.4 參與蛋白和氨基酸代謝的基因66-68
• 3.5 參與細(xì)胞運(yùn)輸?shù)幕?/span>68-69
• 3.6 參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因69-70
• 3.7 參與脅迫響應(yīng)和防御的基因70-71
• 3.8 參與脂質(zhì)代謝的基因71
• 3.9 參與細(xì)胞壁修飾的基因71-72
• 3.10 參與其它代謝的基因72
• 4 小結(jié)72-76
• 第四章 雪柑根系缺硼響應(yīng)microRNAs分離及鑒定76-95
• 1 材料與方法76-83
• 1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)與硼處理76
• 1.2 生物量及根系和葉片硼含量的測(cè)定76
• 1.3 根系類黃酮、花青素、脯氨酸、脯氨酸脫氫酶和谷氨酸脫氫酶測(cè)定76-77
• 1.4 sRNAs的富集、文庫(kù)的構(gòu)建和高通量測(cè)序77
• 1.5 sRNA注釋和miRNA鑒定77-78
• 1.6 缺硼脅迫下miRNAs表達(dá)量差異分析78
• 1.7 MiRNAs靶基因預(yù)測(cè)78-79
• 1.8 差異表達(dá)miRNAs靶基因功能分析79
• 1.9 熒光定量PCR79-81
• 1.10 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析81-83
• 2 結(jié)果與分析83-90
• 2.1 植株生長(zhǎng)及根葉中硼元素的測(cè)定83
• 2.2 根系高通量測(cè)序及miRNAs文庫(kù)分析83-84
• 2.3 根系中保守miRNAs的鑒定84
• 2.4 根系中新的miRNAs的預(yù)測(cè)84
• 2.5 缺硼根系中差異表達(dá)miRNAs84-85
• 2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miRNA表達(dá)量85
• 2.7 差異表達(dá)miRNAs靶基因的預(yù)測(cè)85-88
• 2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)靶基因的表達(dá)88
• 2.9 根系代謝物及酶活性88-90
• 3 討論90-93
• 4 小結(jié)93-95
• 第五章 雪柑葉片缺硼響應(yīng)microRNAs的分離及鑒定95-115
• 1 材料與方法96-101
• 1.1 試驗(yàn)材料培養(yǎng)與硼處理96
• 1.2 sRNAs的富集、文庫(kù)的構(gòu)建和高通量測(cè)序96
• 1.3 sRNA注釋和miRNA鑒定96
• 1.4 缺硼脅迫下miRNAs表達(dá)量差異分析96
• 1.5 MiRNAs靶基因預(yù)測(cè)96
• 1.6 差異表達(dá)miRNAs靶基因功能分析96
• 1.7 熒光定量PCR96-101
• 1.8 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析101
• 2 結(jié)果與分析101-109
• 2.1 葉片中硼及銅元素測(cè)定101
• 2.2 葉片高通量測(cè)序及miRNAs文庫(kù)分析101-102
• 2.3 雪柑葉片中保守的和未知miRNAs鑒定102-103
• 2.4 雪柑葉片中缺硼相關(guān)miRNAs鑒定103
• 2.5 差異表達(dá)miRNAs靶基因的鑒定及其GO分析103-105
• 2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證miRNA表達(dá)量105
• 2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證靶基因表達(dá)量105-109
• 3 討論109-114
• 4 小結(jié)114-115
• 第六章 總結(jié)與展望115-118
• 參考文獻(xiàn)118-146
• 附錄146-271
• 致謝271-272
• 碩博期間發(fā)表論文情況272

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1 盧藝彬;雪柑實(shí)生苗生理生化及基因和microRNA表達(dá)對(duì)缺硼的響應(yīng)[D];福建農(nóng)林大學(xué);2015年

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本文編號(hào)：662102