本文關鍵詞：雪柑實生苗生理生化及基因和microRNA表達對缺硼的響應

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【摘要】：柑橘為亞熱熱帶果樹,土壤淋溶、硼(B)固定、氮磷鈣施用不協(xié)調及氣候等原因致使我國柑橘主產區(qū)常出現(xiàn)不同程度的缺硼現(xiàn)象。本研究以缺硼(0μM H3BO3)和對照(10μM H3BO3)處理15周的雪柑實生苗為試驗材料,通過沙培試驗研究了(1)缺硼對雪柑實生苗生長和根葉生理生化的影響,(2)缺硼脅迫下雪柑根和葉基因的差異表達,(3)缺硼脅迫下雪柑根和葉miRNA差異表達,旨在從生理生化和分子水平闡明柑橘耐缺硼的機制,為柑橘高產優(yōu)質栽培提供科學依據(jù)。1缺硼對雪柑實生苗生長的影響在10 μM H3BO3處理下,雪柑實生苗生長正常,不顯示任何缺硼癥狀,葉片的硼含量介于柑橘葉片硼足夠范圍(30-100μg g-1 DW),而0 μM B處理降低植株根莖葉干重(DW)及根葉硼含量；0 μMB處理葉片中的硼濃度遠低于柑橘葉片足夠硼的范圍,且0 μMB處理雪柑葉片顯示出典型的缺硼癥狀,基于這些結果,0μM B處理被認為缺硼,10 μM B處理被認為硼充足(對照)。2缺硼對雪柑根葉生理生化的影響處理15周后,研究缺硼對氣體交換,碳水化合物、有機酸、氨基酸、可溶性總蛋白、總酚含量及有機酸和氨基酸代謝過程中相關酶活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)缺硼葉片有較多的碳水化合物和較低的CO2同化,可能是碳水化合物對光合作用的反饋抑制作用。缺硼提高了葉片呼吸速率、大部分有機酸(蘋果酸、檸檬酸、草酰乙酸、丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸)含量及參與糖酵解、三羧酸(TCA)循環(huán)、回補途徑的酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NAD-蘋果酸脫氫酶、NAD-蘋果酸酶、NADP-蘋果酸酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶、檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、NADP-異檸檬酸脫氫酶和己糖激酶)活性。總游離氨基酸含量和相關代謝酶(NADH-谷氨酸2-酮戊二酸轉氨酶和谷氨酸草酰乙酸轉氨酶)活性在缺硼葉片中也增強。反之,呼吸速率、非結構碳水化合物、有機酸(蘋果酸、檸檬酸、丙酮酸)及氨基酸含量在缺硼根系中減少,參與糖酵解、TCA循環(huán)、回補途徑的大部分代謝酶(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NADP-蘋果酸酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酶、檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、NAD-異檸檬酸脫氫酶、NADP-異檸檬酸脫氫酶和己糖激酶]和氨基酸代謝酶(硝酸還原酶、NADH-谷氨酸2-酮戊二酸轉氨酶、谷氨酸丙酮酸轉氨酶和谷氨酰胺合成酶]活性也相應降低。但是根系和葉片中的總酚(可溶性總蛋白)含量均增加(降低)�？傊�,呼吸作用、有機酸代謝、回補途徑和氨基酸合成在非結構碳水化合物累積的缺硼葉片中增強,以消耗過量的碳源,在根系中降低以保持碳平衡。3雪柑根葉缺硼響應基因分離與鑒定應用cDNA-AFLP,從缺硼葉片(根系)中分別分離出了54(38)個基因表達上調,和38(45)個基因下調表達,這些差異基因功能主要涉及蛋白和氨基酸代謝、碳水化合物和能量代謝、核酸代謝、細胞轉運、信號轉導和逆境響應。這些基因中大部分都是只從根系或葉片中分離獲得,只有7個(XP 006484536.1、XP_006488862.1、XP_007042812.1、XP_007043058.1、NP_564354.1、XP_006492455.1和BAF01964.1)相同的基因在根系和葉片中具有相同的基因庫注釋ID號,其中有三個(XP_006484536.1、NP_564354.1和XP 006492455.1)基因在根葉中的表達趨勢一致以響應缺硼脅迫。顯然,缺硼脅迫下根系和葉片中的基因表達呈現(xiàn)出巨大的差異性。比如：UDP-糖基轉移酶(UDP-glycosyltransferases, UGTs)的表達在缺硼根系中上調,在缺硼葉片中被下調；然而,ATP合成酶在前者被上調,但在后者不受影響。所有參與信號轉導的缺硼響應基因在根系中被下調,但在缺硼葉片中,除一個基因外,其余差異基因均被上調。在缺硼葉片中,除一個基因外,所有與泛素化和蛋白水解有關的基因均被誘導；然而在缺硼根系中,僅發(fā)現(xiàn)了二個與泛素化有關基因的表達被下調。參與逆境防御的基因在缺硼根系中被下調,但在缺硼葉片中除一個基因外,其余差異基因表達均被上調。4雪柑根系缺硼響應microRNAs分離及鑒定通過Illumina測序,本研究從缺硼根系中分離了52個(40個保守和12個未知)上調表達的和82個(72個保守和10個未知)下調表達的miRNAs,表明了根系具有巨大的代謝靈活性,這可能有助于植株的耐缺硼性。MiRNAs可能通過以下幾個方面來調節(jié)根系對缺硼的適應性：(a)上調miR474表達,下調miR782和miR843表達,激活防御反應、ROS信號和清除；(6)降低miR5023以增加側根數(shù)量,增強miR394表達量以保持有利于缺硼適應的表型；(c)降低miR830、 miR5266和miR3465表達,增強細胞運輸；(d)改善滲透調節(jié)(miR474),調節(jié)其它代謝反應(miR5023和miR821)；(e)增強根系中miR472和miR2118表達,降低與疾病抵抗相關靶基因表達,從而降低根系的抗病性。5雪柑葉片缺硼響應microRNAs分離及鑒定通過Illumina測序,本研究從缺硼和正常供硼葉片中各分離出91個(83個保守和8個未知)上調表達的和81個(75個保守和6個未知)下調表達的miRNAs,表明了缺硼大大地改變了niRNAs表達,這可能有利于柑橘對缺硼的適應性。葉片miRNAs對缺硼的適應性可能主要有以下幾個方面：(a)通過改變miR393、miR160和miR3946的表達,降低TIR1水平和ARF介導的基因表達,從而抑制生長素信號,弱化植株生長和發(fā)育,因而增強植物脅迫耐受性；(6)下調miR159、miR782、miR3946和miR7539,上調MYBs表達,維持適宜的葉片表型,增強植物脅迫抵抗能力；(c)下調miR164、miR6260、miR5929、 miR6214、miR3946和miR3446轉錄水平,活化脅迫響應和抗氧化系統(tǒng)；(d)增強miR5037表達,降低主要協(xié)助轉運蛋白超家族(MFS)基因轉錄水平,從而減弱硼從植物運出；(e)下調miR408,調節(jié)銅平衡、增強超氧化物岐化酶(SOD)活性,參與植物耐缺硼抗性。
【關鍵詞】：缺硼 雪柑 碳水化合物 microRNA cDNA-AFLP Illumina測序 生理生化
【學位授予單位】：福建農林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S666.1
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 第一章 文獻綜述13-32
• 1 土壤中硼營養(yǎng)概述13-14
• 2 植物的硼營養(yǎng)概述14-22
• 2.1 硼在植物中的分布與含量14
• 2.2 硼對植物生長的影響14-16
• 2.3 缺硼脅迫下植物的生理響應16-20
• 2.4 柑橘缺硼研究進展20-21
• 2.5 植物耐缺硼的分子機理21-22
• 3 植物中的miRNA研究進展22-28
• 3.1 植物miRNA的形成和作用機制23-24
• 3.2 植物miRNA功能24-27
• 3.3 植物miRNA的研究方法27-28
• 4 cDNA-AFLP技術應用研究進展28-30
• 5 立題意義30
• 6 研究內容及技術路線30-32
• 6.1 研究內容30-31
• 6.2 技術路線31-32
• 第二章 缺硼對雪柑實生苗主要生理生化代謝的影響32-48
• 1 材料與方法33-35
• 1.1 試驗材料培養(yǎng)與硼處理33
• 1.2 生物量的測定33
• 1.3 根系、葉片硼含量的測定33-34
• 1.4 葉片光合作用和根系、葉片呼吸速率的測定34
• 1.5 根系和葉片有機酸含量測定方法34
• 1.6 有機酸相關代謝酶活性測定34
• 1.7 總酚、可溶性總蛋白和總游離氨基酸的測定34
• 1.8 根系和葉片中氨基酸代謝關鍵酶的測定34-35
• 1.9 試驗設計和統(tǒng)計分析35
• 2 結果與分析35-45
• 2.1 生物量和根葉硼含量35-36
• 2.2 葉片和根系氣體交換36
• 2.3 根葉中主要代謝產物的含量和關鍵酶的活性36-45
• 3 討論45-47
• 3.1 非結構性碳水化合物在缺硼葉片中增加,在缺硼根系中減少45
• 3.2 缺硼導致雪柑葉片呼吸、有機酸代謝和回補途徑上調,而在根系中下調45-46
• 3.3 缺硼下,根系氨基酸合成下調,葉片氨基酸合成則上調46
• 3.4 缺硼增加根系和葉片酚類物質累積46-47
• 4 小結47-48
• 第三章 缺硼脅迫下雪柑根葉cDNA-AFLP分析48-76
• 1 材料與方法48-52
• 1.1 試驗材料培養(yǎng)與硼處理48-49
• 1.2 植株生物量、根系和葉片硼含量的測定49
• 1.3 RNA的提取與檢測49
• 1.4 cDNA的合成49
• 1.5 cDNA的酶切及連接49
• 1.6 預擴增及選擇性擴增49-50
• 1.7 聚丙烯酰胺凝膠電泳50
• 1.8 差異片段的回收、測序及比對50-51
• 1.9 差異片段的熒光定量PCR驗證51
• 1.10 試驗設計和統(tǒng)計分析51-52
• 2 結果與分析52-63
• 2.1 缺硼對雪柑營養(yǎng)生長、根葉中B含量影響52-53
• 2.2 缺硼雪柑根葉基因表達差異53-54
• 2.3 根系和葉片中差異表達基因功能分析54-62
• 2.4 cDNA-AFLP熒光定量驗證62-63
• 3 討論63-72
• 3.1 缺硼相關基因在柑橘根系、葉片中的差異63
• 3.2 參與碳水化合物和能量代謝的基因63-64
• 3.3 參與核酸代謝的基因64-66
• 3.4 參與蛋白和氨基酸代謝的基因66-68
• 3.5 參與細胞運輸?shù)幕?/span>68-69
• 3.6 參與信號轉導的基因69-70
• 3.7 參與脅迫響應和防御的基因70-71
• 3.8 參與脂質代謝的基因71
• 3.9 參與細胞壁修飾的基因71-72
• 3.10 參與其它代謝的基因72
• 4 小結72-76
• 第四章 雪柑根系缺硼響應microRNAs分離及鑒定76-95
• 1 材料與方法76-83
• 1.1 試驗材料培養(yǎng)與硼處理76
• 1.2 生物量及根系和葉片硼含量的測定76
• 1.3 根系類黃酮、花青素、脯氨酸、脯氨酸脫氫酶和谷氨酸脫氫酶測定76-77
• 1.4 sRNAs的富集、文庫的構建和高通量測序77
• 1.5 sRNA注釋和miRNA鑒定77-78
• 1.6 缺硼脅迫下miRNAs表達量差異分析78
• 1.7 MiRNAs靶基因預測78-79
• 1.8 差異表達miRNAs靶基因功能分析79
• 1.9 熒光定量PCR79-81
• 1.10 試驗設計及數(shù)據(jù)分析81-83
• 2 結果與分析83-90
• 2.1 植株生長及根葉中硼元素的測定83
• 2.2 根系高通量測序及miRNAs文庫分析83-84
• 2.3 根系中保守miRNAs的鑒定84
• 2.4 根系中新的miRNAs的預測84
• 2.5 缺硼根系中差異表達miRNAs84-85
• 2.6 實時熒光定量PCR檢測miRNA表達量85
• 2.7 差異表達miRNAs靶基因的預測85-88
• 2.8 實時熒光定量PCR檢測靶基因的表達88
• 2.9 根系代謝物及酶活性88-90
• 3 討論90-93
• 4 小結93-95
• 第五章 雪柑葉片缺硼響應microRNAs的分離及鑒定95-115
• 1 材料與方法96-101
• 1.1 試驗材料培養(yǎng)與硼處理96
• 1.2 sRNAs的富集、文庫的構建和高通量測序96
• 1.3 sRNA注釋和miRNA鑒定96
• 1.4 缺硼脅迫下miRNAs表達量差異分析96
• 1.5 MiRNAs靶基因預測96
• 1.6 差異表達miRNAs靶基因功能分析96
• 1.7 熒光定量PCR96-101
• 1.8 試驗設計及數(shù)據(jù)分析101
• 2 結果與分析101-109
• 2.1 葉片中硼及銅元素測定101
• 2.2 葉片高通量測序及miRNAs文庫分析101-102
• 2.3 雪柑葉片中保守的和未知miRNAs鑒定102-103
• 2.4 雪柑葉片中缺硼相關miRNAs鑒定103
• 2.5 差異表達miRNAs靶基因的鑒定及其GO分析103-105
• 2.6 實時熒光定量PCR驗證miRNA表達量105
• 2.7 實時熒光定量PCR驗證靶基因表達量105-109
• 3 討論109-114
• 4 小結114-115
• 第六章 總結與展望115-118
• 參考文獻118-146
• 附錄146-271
• 致謝271-272
• 碩博期間發(fā)表論文情況272

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中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 盧藝彬;雪柑實生苗生理生化及基因和microRNA表達對缺硼的響應[D];福建農林大學;2015年

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本文編號：662102