本文關(guān)鍵詞：煙草四種主要病毒分子變異及植物提取物WCT-Ⅱ抗TMV作用機(jī)理研究

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【摘要】：煙草普通花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、煙草蝕紋病毒(Tobacco etch virus,TEV)和馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)引起的病毒病害是我國(guó)煙草安全生產(chǎn)的重大威脅。為明確TMV,CMV,TEV和PVY在我國(guó)煙草產(chǎn)區(qū)的分布、分子變異等信息,本研究在我國(guó)12個(gè)煙草主產(chǎn)區(qū)展開病毒病害的調(diào)查與分析。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究了植物提取物WCT-II的抗病毒活性和作用機(jī)理,為開發(fā)環(huán)境友好型植物病毒的防控技術(shù)提供了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。2010和2011年,本實(shí)驗(yàn)在我國(guó)12個(gè)煙草主產(chǎn)區(qū)共采集409份樣品,利用DAS-ELISA和RT-PCR等技術(shù)對(duì)這些樣品進(jìn)行了分析。檢測(cè)結(jié)果表明TMV,CMV,TEV和PVY廣泛分布在我國(guó)12煙草主產(chǎn)區(qū),平均檢出率在50%以上。不同地區(qū),病毒檢出率呈現(xiàn)了多樣性。陜西省煙草產(chǎn)區(qū)病毒危害最重,平均檢出率為75.95%;其次為河南,檢出率為74.78%;湖南檢出率為74.26%;湖北最輕,檢出率為58.69%。這些地區(qū)已經(jīng)是煙草病毒病危害最為嚴(yán)重的地區(qū),嚴(yán)重威脅當(dāng)?shù)責(zé)煵菁捌渌?jīng)濟(jì)作物的安全生產(chǎn),因此有效控制病毒病的危害已經(jīng)成為一項(xiàng)緊迫任務(wù)。在不同年份,這四種病毒的檢出率也有差異。統(tǒng)計(jì)2010年和2011年的調(diào)查結(jié)果顯示,煙草病毒在2010年平均檢出率為76.62%,明顯高于2011年的60%。這說明煙草病毒的檢出率呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的變化趨勢(shì),這可能與氣候、農(nóng)事活動(dòng)等因素有關(guān),因此多年份、多區(qū)域的調(diào)查才能較為真實(shí)的反應(yīng)煙草病毒的危害情況。本實(shí)驗(yàn)從采集的樣品中共分離鑒定到18個(gè)TMV分離物,21個(gè)CMV分離物,15個(gè)TEV分離物,21個(gè)PVY分離物。與在線數(shù)據(jù)比對(duì)顯示,這四種病毒外殼蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列的一致率分別為:TMV是97%~100%和72%~100%,CMV為81%~100%和78%~100%,TEV為96%~100%和97%~100%,PVY為96%~100%和97%~100%。以這些分離物為基礎(chǔ),結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)在線數(shù)據(jù),采用RDP4軟件對(duì)這些分離物的外殼蛋白核苷酸序列進(jìn)行了重組分析。3個(gè)明顯的重組事件從這些分離分離物中鑒定得到,其中CMV分離物中鑒定出1個(gè),TEV分離物中鑒定出1個(gè),PVY分離物中鑒定出1個(gè)。Phylogenetic network分析結(jié)果表明CMV,TEV和PVY的分離物呈現(xiàn)非樹形的Phylogenetic network樹,說明重組對(duì)CMV,TEV和PVY遺傳變異起著重要的作用,是影響CMV,TEV和PVY種群變異的重要因素。此外,利用MEGA軟件計(jì)算了這些分離物的non-synonymous和synonymous sites(d N/d S比值)的比值。結(jié)果顯示TMV,CMV,TEV和PVY分離物外殼蛋白的d N值明顯小于d S值,即d N/d S ratio小于1,說明TMV,CMV,TEV和PVY分離物的外殼蛋白基因受到負(fù)向選擇的影響。負(fù)向選擇也是影響四種煙草病毒種群變異的重要因素�；赥MV,CMV,TEV和PVY外殼蛋白的核苷酸序列,利用MEGA4軟件,系統(tǒng)分析這四種病毒的遺傳變異。依據(jù)TMV分離物建立的系統(tǒng)發(fā)育樹,34個(gè)TMV分離物(16個(gè)來自網(wǎng)上公布的序列)被分成了兩個(gè)亞組,Group I和II(bootstrap support values60%)。38個(gè)CMV分離物分到了Subgroup I,5個(gè)CMV分離物分到了Subgroup II。39個(gè)TEV分離物(24個(gè)來源于數(shù)據(jù)庫(kù))被分成了四個(gè)組,Groups I,II,III和IV(bootstrap support values90%)。73個(gè)PVY分離物(52個(gè)來源于網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù))被分成了2個(gè)組,Group I和II(bootstrap support values90%)。該結(jié)果表明TMV,CMV,TEV和PVY分離物存在明顯的遺傳變異。為進(jìn)一步分析這些分離物的多樣性,本實(shí)驗(yàn)采用MEGA4軟件分別計(jì)算了這些分離物組內(nèi)和組間的遺傳距離,結(jié)果表明組間的遺傳距離明顯大于組內(nèi)的。這說明,組間的遺傳多樣性要大于組內(nèi)的,進(jìn)一步說明這四種病毒分離物存在明顯的遺傳多樣性。有效的防治這些煙草病毒病已經(jīng)成為了一大難題。針對(duì)這一難題,本實(shí)驗(yàn)采用半葉枯斑法、定量PCR等技術(shù)檢測(cè)了生物源活性物質(zhì)WCT-II抗TMV的活性、作用機(jī)理。在WCT-II處理普通煙草(Nicotiana tabacum)后,本實(shí)驗(yàn)采集了煙草葉片,測(cè)量了SOD酶、POD酶、PPO酶活性、過氧化氫含量的變化及PR-1基因表達(dá)量差異。目前實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,WCT-II處理6 h后,SOD酶、POD酶、PPO酶活性及過氧化氫含量開始上升,同時(shí),PR-1基因開始被誘導(dǎo)表達(dá);12 h后,PPO活性和SOD活性出現(xiàn)峰值;在處理24 h后,POD酶活性出現(xiàn)峰值;PR-1基因表達(dá)量達(dá)到高峰,為對(duì)照組煙草的3.16倍;過氧化氫含量也達(dá)到高峰。隨后,SOD酶、POD酶、PPO酶活性、過氧化氫含量的及PR-1基因表達(dá)量均逐漸下降到對(duì)照水平。該實(shí)驗(yàn)說明在溫室條件下,WCT-II可以通過有效誘導(dǎo)煙草SOD酶、POD酶、PPO酶活性上升,誘導(dǎo)過氧化氫大量積累和PR-1基因的上調(diào)表達(dá),最終誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗TMV的活性。TMV,CMV,TEV和PVY在我國(guó)煙草主產(chǎn)區(qū)廣泛分布,引起的病毒病害已經(jīng)成為危害我國(guó)煙草安全生產(chǎn)的重要因素。這些病毒分離物存在明顯的遺傳變異,重組和負(fù)向選擇是影響這些病毒類群遺傳變異的重要因素。作為植物源活性物質(zhì),WCT-II能有效誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)的抗病性,為有效防治TMV,CMV,TEV和PVY等煙草病毒提供了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：煙草病毒 分子變異 重組 負(fù)向選擇 WCT-II
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S435.72
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-39
• 1.1 植物病毒及其危害14-15
• 1.2 我國(guó)主要的煙草病毒病及分子生物學(xué)特性15-21
• 1.2.1 煙草普通花葉病毒（Tobacco mosaic virus, TMV)15-16
• 1.2.2 黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus, CMV)16-18
• 1.2.3 煙草蝕紋病毒（Tobacco etch virus, TEV)18-20
• 1.2.4 煙草馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y, PVY)20-21
• 1.3 植物病毒的檢測(cè)技術(shù)21-30
• 1.3.1 生物學(xué)方法21-22
• 1.3.2 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)22
• 1.3.3 電鏡技術(shù)22-23
• 1.3.4 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)23-29
• 1.3.5 其他檢測(cè)方法29-30
• 1.4 植物RNA病毒的分子變異30-33
• 1.4.1 突變30-31
• 1.4.2 重組31-32
• 1.4.3 分子重排32-33
• 1.4.4 病毒RNA的缺失及缺失干擾33
• 1.5 植物源病毒抑制物質(zhì)的研究進(jìn)展33-37
• 1.5.1 植物源抗病毒活性物質(zhì)34-36
• 1.5.2 植物源抗病毒物質(zhì)作用機(jī)理36-37
• 1.6 本項(xiàng)目研究的目的與意義37-39
• 第二章 煙草主要病毒的發(fā)生39-52
• 前言39
• 2.1 材料與方法39-45
• 2.1.1 田間調(diào)查與樣品采集39-40
• 2.1.2 引物設(shè)計(jì)40
• 2.1.3 血清學(xué)檢測(cè)樣品40-41
• 2.1.4 提取樣品總RNA41-42
• 2.1.5 反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增42-43
• 2.1.6 PCR分別擴(kuò)增四種煙草病毒的外殼蛋白43
• 2.1.7 四種煙草病毒的外殼蛋白基因序列測(cè)定43-45
• 2.2 結(jié)果與分析45-50
• 2.2.1 田間感病煙草的癥狀表現(xiàn)45
• 2.2.2 煙草主要病毒的發(fā)生與分布45-46
• 2.2.3 TMV的發(fā)生與分布46-47
• 2.2.4 CMV的發(fā)生與分布47-48
• 2.2.5 TEV的發(fā)生與分布48-49
• 2.2.6 PVY的發(fā)生與分布49
• 2.2.7 煙草病毒在田間的侵染形式49-50
• 2.3 討論50-51
• 2.4 小結(jié)51-52
• 第三章 煙草四種主要病毒的分子變異52-81
• 前言52
• 3.1 材料與方法52-54
• 3.1.1 樣品采集52
• 3.1.2 RT-PCR52-53
• 3.1.3 外殼蛋白序列測(cè)定53
• 3.1.4 外殼蛋白序列分析53
• 3.1.5 多樣性分析53
• 3.1.6 重組分析53
• 3.1.7 種群和選擇壓分析53-54
• 3.2 結(jié)果與分析54-78
• 3.2.1 四種煙草病毒分離物54-56
• 3.2.2 序列一致性分析56-63
• 3.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析63-72
• 3.2.4 重組分析72-74
• 3.2.5 種群統(tǒng)計(jì)分析74-77
• 3.2.6 選擇壓分析77-78
• 3.3 討論78-79
• 3.4 小結(jié)79-81
• 第四章 植物提取物WCT-II抗TMV活性分析81-92
• 前言81
• 4.1 材料與方法81-85
• 4.1.1 供試藥劑和植物材料81
• 4.1.2 供試毒源81-82
• 4.1.3 設(shè)計(jì)TMV特異引物82
• 4.1.4 RNA提取82-83
• 4.1.5 RT-PCR83-84
• 4.1.6 Real-time PCR84
• 4.1.7 WCT-II抗TMV活性84-85
• 4.2 結(jié)果與分析85-90
• 4.2.1 TMV特異的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系85-87
• 4.2.2 WCT-II對(duì)TMV的鈍化作用87-88
• 4.2.3 半葉枯斑法測(cè)定WCT-II對(duì)TMV的防治作用88-89
• 4.2.4 系統(tǒng)寄主上測(cè)定WCT-II對(duì)TMV的防治作用89-90
• 4.3 討論90-91
• 4.4 小結(jié)91-92
• 第五章 植物提取物WCT-II抗TMV機(jī)理初步研究92-106
• 前言92
• 5.1 材料與方法92-99
• 5.1.1 供試材料92-93
• 5.1.2 引物設(shè)計(jì)93
• 5.1.3 SOD、PPO、POD活性測(cè)定93-96
• 5.1.4 過氧化氫含量測(cè)定96-97
• 5.1.5 煙草PR-1 基因表達(dá)量分析97-99
• 5.2 結(jié)果與分析99-104
• 5.2.1 WCT-II對(duì)SOD活性影響99-100
• 5.2.2 WCT-II對(duì)POD活性影響100-101
• 5.2.3 WCT-II對(duì)PPO活性影響101
• 5.2.4 WCT-II對(duì)過氧化氫影響101-102
• 5.2.5 煙草PR-1 基因特異的real-time PCR體系102-103
• 5.2.6 WCT-II對(duì)PR-1 基因表達(dá)量影響103-104
• 5.3 討論104-105
• 5.4 小結(jié)105-106
• 第六章 結(jié)論和創(chuàng)新點(diǎn)106-107
• 參考文獻(xiàn)107-118
• 附表118-124
• 致謝124-125
• 作者簡(jiǎn)介125

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：632687