本文關(guān)鍵詞：解淀粉芽孢桿菌HRH317抗菌蛋白鑒定及抑菌機(jī)理研究

  更多相關(guān)文章： 解淀粉芽孢桿菌 抗茵蛋白 分離純化 抑菌機(jī)理 生防應(yīng)用

【摘要】：真菌病害是引起作物減產(chǎn)與品質(zhì)降低的主要因素。目前生物防治逐步替代化學(xué)農(nóng)藥是一種趨勢(shì),然而在生防菌中芽孢桿菌的抑菌作用尤為突出。本文以具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的解淀粉芽孢桿菌菌株HRH317為主要研究對(duì)象,對(duì)其代謝產(chǎn)生的抑制小麥赤霉病禾谷鐮孢菌的抗菌蛋白進(jìn)行了研究,為其在生物防治應(yīng)用領(lǐng)域提供理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容包括：優(yōu)化了抗菌蛋白的發(fā)酵條件；分離純化與鑒定了抗菌蛋白；研究了抗菌蛋白的穩(wěn)定性；闡明了抗菌蛋白抑制禾谷鐮孢菌的作用機(jī)理；驗(yàn)證了抗菌蛋白的防效、土壤中定殖力及生物安全性評(píng)價(jià),結(jié)果如下。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法優(yōu)化了菌株HRH317抗菌蛋白的發(fā)酵條件。結(jié)果表明,抗菌蛋白的發(fā)酵最佳條件：在裝有30mL pH值為7.0的NB培養(yǎng)液中,接種量4%,37℃下振蕩培養(yǎng)24h,轉(zhuǎn)速200r/min,菌株產(chǎn)抗菌蛋白的抑菌效果達(dá)到最佳。菌株HRH317發(fā)酵液經(jīng)飽和硫酸銨沉淀得到蛋白粗提物,經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow與Sephadex G-200柱層析分離純化得到強(qiáng)烈抑制禾谷鐮孢菌的抗菌蛋白。通過SDS-PAGE電泳檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)：呈現(xiàn)出一條單獨(dú)條帶,其表觀分子質(zhì)量約為36.0kD,測(cè)得抗菌蛋白含量為5.81±0.04mg/mL。采用HPLC法檢測(cè)出抗菌蛋白氨基酸組成成分�？咕鞍捉�(jīng)過SDS-PAGE電泳之后,將條帶切下進(jìn)行膠內(nèi)胰蛋白酶酶切,采用納升液相電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(NanoLC-ESI/MS/MS)分析鑒定。經(jīng)電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜共獲得3個(gè)具有代表性的肽序列,分別為ELISNASDALDK、DIQMTQSPSSLSASVGDR. DSTYSLSSTLTLSKo在Matrix Science NCBI數(shù)據(jù)庫中鑒定,尚無發(fā)現(xiàn)完全和這些肽段的氨基酸相同的序列。其中發(fā)現(xiàn)1個(gè)具有相關(guān)性的蛋白質(zhì),與芽孢桿菌分泌的草酸脫羧酶部分同源,表明菌株HRH317所產(chǎn)抗菌蛋白是一種新的蛋白質(zhì)�？咕鞍追�(wěn)定性研究結(jié)果顯示,對(duì)熱、酸堿有良好的穩(wěn)定性,對(duì)蛋白酶K不敏感、而對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶較敏感；經(jīng)紫外線照射與反復(fù)凍融以后仍然具有良好的抑菌活性�？咕鞍滓志V非常廣,對(duì)常見的12種病原菌都有明顯抑菌作用,表明了該抗菌蛋白在植物真菌病害防治和食品防腐方面具有廣闊的開發(fā)與應(yīng)用前景。采用掃描電鏡(SEM)、透射電鏡(TEM)、細(xì)胞膜通透性測(cè)定等方法,初步明確了抗菌蛋白抑制禾谷鐮孢菌的作用機(jī)理。揭示了抗菌蛋白抑制禾谷鐮孢菌菌絲生長(zhǎng),抑制孢子萌發(fā),同時(shí)造成病原菌細(xì)胞器紊亂,細(xì)胞質(zhì)降解,膜通透性增大。同時(shí),該抗菌蛋白對(duì)細(xì)胞壁的破壞也是重要機(jī)理之一,但對(duì)禾谷鐮孢菌菌絲中蛋白質(zhì)的合成無顯著影響,禾谷鐮孢菌蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳圖譜檢測(cè)結(jié)果與之吻合。本文通過光照培養(yǎng)箱及盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),解淀粉芽孢桿菌HRH317對(duì)由禾谷鐮孢菌引起的小麥赤霉病的防治效果明顯,經(jīng)處理的小麥根部病情指數(shù)較對(duì)照降低了62.5%,并且有很好的促生作用。經(jīng)浸種和灌根處理后,該菌株能夠很好的在土壤中定殖。經(jīng)過對(duì)回收的土壤中拮抗菌HRH317進(jìn)行抑菌試驗(yàn)研究表明仍具有抑菌活性,抑菌圈直徑達(dá)到19.6cm。菌株HRH317通過急毒性試驗(yàn),結(jié)果顯示對(duì)小白鼠沒有致病性,證明了該菌株良好的生物安全性。
【關(guān)鍵詞】：解淀粉芽孢桿菌 抗茵蛋白 分離純化 抑菌機(jī)理 生防應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S476
【目錄】：

• 摘要9-11
• 第一章 文獻(xiàn)綜述11-28
• 1. 作物病害生物防治研究概況11-13
• 1.1 小麥赤霉病的發(fā)生與危害11
• 1.2 生物防治11-13
• 1.3 生物防治的發(fā)展趨勢(shì)13
• 2. 解淀粉芽孢桿菌的研究進(jìn)展13-15
• 2.1 菌株分離、篩選及鑒定13-14
• 2.2 菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)14-15
• 3. 抗菌物質(zhì)分離、純化及鑒定15-19
• 3.1 抗菌物質(zhì)活性的測(cè)定15-16
• 3.2 抗菌物質(zhì)的分離、純化16-17
• 3.3 抗菌物質(zhì)的鑒定17-19
• 4. 抗菌物質(zhì)抑菌機(jī)理19-23
• 4.1 競(jìng)爭(zhēng)作用20
• 4.2 拮抗作用20-22
• 4.3 誘導(dǎo)抗性22-23
• 5. 解淀粉芽孢桿菌對(duì)作物真菌病害生物防治研究現(xiàn)狀23-26
• 5.1 在作物真菌病害方面的應(yīng)用23-24
• 5.2 在果蔬防腐與保鮮上的應(yīng)用24-25
• 5.3 在生物防治上存在的問題及措施25-26
• 6. 本研究的目的和意義26-27
• 7. 本研究設(shè)計(jì)思路27-28
• 第二章 解淀粉芽孢桿菌HRH317產(chǎn)抗菌蛋白發(fā)酵條件優(yōu)化28-40
• 1. 材料與儀器28-29
• 1.1 材料28-29
• 1.2 主要儀器29
• 2. 試驗(yàn)方法29-31
• 2.1 HRH317菌株種子液的制備29
• 2.2 HRH317菌株抗菌蛋白粗提液的制備29-30
• 2.3 指示菌菌懸液的制備30
• 2.4 HRH317菌株抗菌蛋白粗提液的抑菌活性測(cè)定30
• 2.5 HRH317菌株產(chǎn)抗菌蛋白發(fā)酵條件的優(yōu)化30-31
• 3. 結(jié)果與分析31-38
• 3.1 單因素試驗(yàn)31-34
• 3.2 響應(yīng)面分析34-38
• 4. 討論38-39
• 5. 小結(jié)39-40
• 第三章 解淀粉芽孢桿菌HRH317所產(chǎn)抗菌蛋白的分離純化40-51
• 1. 材料與儀器40-41
• 1.1 材料40
• 1.2 主要儀器40-41
• 2. 試驗(yàn)方法41-43
• 2.1 HRH317菌株抗菌蛋白粗提液的制備及抑菌活性41
• 2.2 不同飽和度硫酸銨分級(jí)沉淀抗菌粗蛋白41
• 2.3 HRH317菌株抗菌蛋白的分離純化41-42
• 2.4 HRH317菌株抗菌蛋白分子量測(cè)定42
• 2.5 抗菌蛋白含量的測(cè)定42
• 2.6 HPLC測(cè)定抗菌蛋白氨基酸組成分析42
• 2.7 抗菌活性測(cè)定方法42-43
• 3. 結(jié)果與分析43-49
• 3.1 抗菌蛋白粗提液抑菌活性檢測(cè)43
• 3.2 最適飽和度硫酸銨沉淀抗菌粗蛋白的確定43-44
• 3.3 HRH317菌株抗菌蛋白的分離純化44-46
• 3.4 SDS-PAGE檢測(cè)HRH317抗菌蛋白分子量46-47
• 3.5 蛋白含量測(cè)定47-48
• 3.6 HPLC測(cè)定抗菌蛋白氨基酸組成分析48-49
• 4 討論49-50
• 5 小結(jié)50-51
• 第四章 解淀粉芽孢桿菌HRH317抗菌蛋白的鑒定51-61
• 1. 材料與儀器51-52
• 1.1 材料51
• 1.2 主要儀器51-52
• 2. 試驗(yàn)方法52
• 2.1 納升液相電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(NanoLC-ESI/MS/MS)分析52
• 2.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索和分析52
• 3. 結(jié)果與分析52-59
• 3.1 抗菌蛋白的NanoLC-ESI/MS/MS質(zhì)譜分析52-59
• 4. 討論59
• 5. 小結(jié)59-61
• 第五章 解淀粉芽孢桿菌HRH317所產(chǎn)抗菌蛋白穩(wěn)定性及抑菌譜研究61-71
• 1. 材料與儀器61-62
• 1.1 材料61-62
• 1.2 主要儀器62
• 2. 試驗(yàn)方法62-63
• 2.1 抗菌蛋白的制備62
• 2.2 溫度對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響62
• 2.3 pH對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響62
• 2.4 蛋白酶對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響62
• 2.5 紫外線、反復(fù)凍融對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響62-63
• 2.6 抗菌蛋白抑菌譜測(cè)定63
• 2.7 抑菌活性測(cè)定63
• 3. 結(jié)果與分析63-69
• 3.1 溫度對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響63-64
• 3.2 pH對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響64
• 3.3 蛋白酶對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響64-66
• 3.4 紫外線、反復(fù)凍融對(duì)抗菌蛋白抑菌活性的影響66
• 3.5 抗菌蛋白抑菌譜66-69
• 4. 討論69-70
• 5. 小結(jié)70-71
• 第六章 抗菌蛋白抑制禾谷鐮孢菌的機(jī)理研究71-83
• 1. 材料與儀器71-72
• 1.1 材料71
• 1.2 主要儀器71-72
• 2. 試驗(yàn)方法72-74
• 2.1 抗菌蛋白的制備72
• 2.2 抗菌蛋白對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制作用72
• 2.3 抗菌蛋白對(duì)病原菌菌絲形態(tài)的抑制作用72
• 2.4 抗菌蛋白對(duì)病原菌菌絲細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響72-73
• 2.5 抗菌蛋白對(duì)病原菌菌絲細(xì)胞壁的影響73
• 2.6 抗菌蛋白對(duì)病原菌細(xì)胞膜通透性的影響73
• 2.7 抗菌蛋白對(duì)病原菌菌絲蛋白質(zhì)合成的影響73-74
• 2.8 禾谷鐮孢菌蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳檢測(cè)74
• 3. 結(jié)果與分析74-80
• 3.1 抗菌蛋白對(duì)禾谷鐮孢菌孢子萌發(fā)的影響74
• 3.2 抗菌蛋白對(duì)禾谷鐮孢菌菌絲形態(tài)的影響74-76
• 3.3 抗菌蛋白對(duì)禾谷鐮孢菌菌絲體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響76-78
• 3.4 抗菌蛋白對(duì)病原菌菌絲細(xì)胞壁的影響78
• 3.5 抗菌蛋白對(duì)病原菌細(xì)胞膜通透性的影響78-79
• 3.6 抗菌蛋白對(duì)病原菌菌絲蛋白質(zhì)合成的影響79-80
• 3.7 抗菌蛋白處理禾谷鐮孢菌蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳分析80
• 4. 討論80-81
• 5. 小結(jié)81-83
• 第七章 菌株HRH317的生防應(yīng)用及生物安全性評(píng)價(jià)研究83-92
• 1. 材料與儀器83-84
• 1.1 材料83-84
• 1.2 主要儀器84
• 2. 試驗(yàn)方法84-86
• 2.1 解淀粉芽孢桿菌HRH317對(duì)小麥赤霉病的防效測(cè)定84-85
• 2.2 解淀粉芽孢桿菌HRH317土壤中定殖能力的測(cè)定85
• 2.3 生防菌株HRH317生物安全性的初步評(píng)價(jià)85-86
• 3. 結(jié)果與分析86-90
• 3.1 解淀粉芽孢桿菌HRH317對(duì)小麥赤霉病的防效與促生影響86-88
• 3.2 解淀粉芽孢桿菌HRH317土壤中定殖的能力88-89
• 3.3 解淀粉芽孢桿菌HRH317生物安全性初步評(píng)價(jià)89-90
• 4 討論90-91
• 5 小結(jié)91-92
• 全文結(jié)論92-93
• 縮略表93-94
• 參考文獻(xiàn)94-105
• Abstract105-107
• 攻讀博士期間發(fā)表的論文107-109
• 致謝109

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6 張寧;潘乃z_;陳章良;;細(xì)菌中一種抗菌蛋白的分離純化及特性分析[J];Journal of Integrative Plant Biology;1993年05期

7 Y.Kato;李文楚;;家蠶抗菌蛋白Ceeropin B cDNAs的表達(dá)及其特性[J];國(guó)外農(nóng)學(xué)(蠶業(yè));1994年02期

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6 柏鳴;周立;;家蠅抗菌蛋白的分離純化及部分性質(zhì)研究[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第八屆會(huì)員代表大會(huì)暨全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2001年

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