本文關(guān)鍵詞：擬南芥分泌肽PIP1調(diào)節(jié)植物免疫的分子機(jī)制

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【摘要】：病原微生物是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育和限制作物產(chǎn)量的主要威脅之一。因此,揭示植物免疫機(jī)制對(duì)于發(fā)展抗病、高產(chǎn)的現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)具有重要意義。已有研究表明,植物可以依靠細(xì)胞表面模式識(shí)別受體識(shí)別病原菌相關(guān)分子模式pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)啟動(dòng)PAMPs-觸發(fā)免疫(PTI, PAMP-Triggered Immunity)。此外,植物還能夠通過(guò)細(xì)胞表面受體識(shí)別內(nèi)源信號(hào)分子,比如肽類、胞外ATP (e ATP),觸發(fā)PTI類似反應(yīng)。水楊酸、乙烯等植物激素對(duì)PTI的調(diào)控發(fā)揮至關(guān)重要的作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),一類新的植物激素——分泌肽在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)外界脅迫等生理進(jìn)程中發(fā)揮重要的作用,然而它們參與植物免疫調(diào)節(jié)的分子機(jī)制尚未被深入研究。為了鑒定可能參與擬南芥PTI調(diào)節(jié)的植物肽信號(hào),本研究通過(guò)分析PAMP flg22誘導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)錄組,鑒定了25個(gè)被flg22誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的肽前體基因。其中,三個(gè)未知功能基因(At4g28469、At4g37290和At2g23270,分別命名為prePIP1、preP1P2和prePIP3)屬于同一基因家族。該家族基因進(jìn)化上比較保守。同源比對(duì)分析顯示擬南芥至少具有11個(gè)該家族成員,在大豆、葡萄、玉米和水稻等其他多種單子葉植物和雙子葉植物中也具有其同源基因。序列分析顯示該家族蛋白為典型的分泌肽前體蛋白,其N端具有信號(hào)肽,C端具有-13氨基酸組成的保守區(qū),信號(hào)肽和保守區(qū)之間為序列保守性低的可變區(qū)。為了分析該基因家族可能的功能,我們對(duì)其代表成員prePIP1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表達(dá)模式、細(xì)胞定位、功能位點(diǎn)進(jìn)行了系統(tǒng)分析。結(jié)果顯示,病原菌Pseudomonas syingae、 Fusarium oxygenium、PAMPs flg22、幾丁質(zhì)和激素水楊酸能夠誘導(dǎo)prePIPl表達(dá)。通過(guò)對(duì)prePIP1p：：GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥熒光顯微觀察,我們發(fā)現(xiàn)prePIP1主要在保衛(wèi)細(xì)胞、水孔、表皮毛和維管組織中表達(dá)。熒光顯微觀察瞬時(shí)表達(dá)prePIP1-GFP融合基因的煙草葉片顯示prePIP1定位于胞外。蛋白體外切割分析和質(zhì)譜分析顯示擬南芥胞外蛋白能夠在prePIP1 C端進(jìn)行切割,并釋放C端保守區(qū)組成的肽。體外施加化學(xué)合成的prePIP1 C端13個(gè)氨基酸組成的多肽PIP1能夠模擬過(guò)表達(dá)prePIP1引起的擬南芥主根生長(zhǎng)變短的表型,表明PIP1可能作為prePIP1的成熟肽發(fā)揮其生理功能。通過(guò)比較脯氨酸未羥基化和羥基化的PIP1對(duì)主根生長(zhǎng)抑制的活性,我們還發(fā)現(xiàn)PIP1的第5個(gè)脯氨酸(Pro-5)羥基化能夠提高該多肽的根抑制活性。為了闡明PIP1的免疫相關(guān)作用機(jī)制,我們分析了該多肽的免疫誘導(dǎo)活性。通過(guò)prePIP1全長(zhǎng)、N端信號(hào)肽或C末端保守區(qū)缺失基因分別與PTI標(biāo)志基因FRK1啟動(dòng)子啟動(dòng)的螢光蟲熒光素酶基因(Luciferase, LUC)共轉(zhuǎn)化的擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體,并分析轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體LUC活性,結(jié)果顯示原生質(zhì)體表達(dá)的prePIP1能夠激活FRK1表達(dá)依賴于其C末端保守區(qū)。對(duì)化學(xué)合成的Pro-5羥基化修飾的PIP 1多肽進(jìn)行免疫誘導(dǎo)活性分析,結(jié)果顯示PIP1能夠誘導(dǎo)包括免疫基因表達(dá)、MAPK激活、ROS產(chǎn)生、氣孔關(guān)閉和胼胝質(zhì)沉積等免疫反應(yīng)和增強(qiáng)擬南芥對(duì)病原細(xì)菌Pst DC3000的抗性。并且,過(guò)表達(dá)prePIP1和prePIP2能夠增強(qiáng)擬南芥對(duì)根寄生真菌Foc699的抗性。以上結(jié)果表明PIP1能夠激活PTI類似免疫反應(yīng)和增強(qiáng)擬南芥對(duì)病原菌的抗性。為了鑒定PIP1的受體,我們分析了PIP1在部分受病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的XI LRR-RLK基因突變體上的相關(guān)活性。結(jié)果顯示PIP1在rlk7突變體上不能抑制根生長(zhǎng)和誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。通過(guò)生物素-推拉實(shí)驗(yàn)、化學(xué)交聯(lián)和受體-配體結(jié)合分析證明RLK7為PIP1的受體。為了進(jìn)一步揭示PIP1-RLK7介導(dǎo)的植物免疫信號(hào)機(jī)制,我們對(duì)比分析了PIP1-RLK7與PEP1-PEPR1的作用機(jī)制。結(jié)果顯示二者激活的早期免疫反應(yīng)均依賴于BAK1,而只有PEP1-PEPR1信號(hào)依賴于BIK1。并且,兩個(gè)信號(hào)通路之間存在協(xié)同作用,二者共同參與對(duì)擬南芥PTI的放大。此外,我們還分析了PIP1誘導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)錄組。結(jié)果顯示PIP1能夠上調(diào)與flg22、PEP1類似的早期免疫相關(guān)基因表達(dá)。由于PIP1和flg22共同誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的基因顯著富集BTH(SA功能類似物)誘導(dǎo)表達(dá)基因,RLK7突變顯著降低了flg22誘導(dǎo)的SA信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)。并且,prePIP1過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)flg22和SA誘導(dǎo)的PR1表達(dá)和對(duì)病原菌Pst DC3000的抗性,相反RLK7突變減弱了flg22和SA誘導(dǎo)的PRl表達(dá)和對(duì)病原菌DC3000的抗性。以上結(jié)果表明PIP1-RLK7能夠通過(guò)激活SA信號(hào)增強(qiáng)flg22信號(hào)。此外,我們還發(fā)現(xiàn)SA信號(hào)能夠促進(jìn)flg22對(duì)prePIP1的誘導(dǎo)表達(dá),而JA信號(hào)抑制了對(duì)prePIP1的誘導(dǎo)表達(dá)。因此,PIP1-RLK7信號(hào)和SA信號(hào)通過(guò)形成正反饋回路來(lái)放大flg22誘導(dǎo)的免疫信號(hào)。綜上所述,我們?cè)跀M南芥中鑒定了一類新的分泌肽PIP1及其受體RLK7。并且,我們證明PIP1-RLK7通過(guò)與SA激素信號(hào)形成正反饋回路放大flg22誘導(dǎo)的PTI信號(hào)。
【關(guān)鍵詞】：植物免疫 分泌肽 受體激酶 水楊酸
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S432.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第1章 文獻(xiàn)綜述11-45
• 1.1 植物免疫系統(tǒng)11-13
• 1.2 PAMPs和PTI激活13-20
• 1.3 植物內(nèi)源免疫激發(fā)子20-25
• 1.4 植物分泌肽參與的免疫調(diào)節(jié)25-28
• 1.5 類受體激酶(Receptor-like kinases,RLKs)28-35
• 1.6 PRRs介導(dǎo)的植物免疫激活及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)35-43
• 1.7 研究目的和主要研究?jī)?nèi)容43-45
• 1.7.1 研究目的43-44
• 1.7.2 主要研究?jī)?nèi)容44-45
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料與方法45-60
• 2.1 材料與方法45-60
• 2.1.1 材料和試劑45-48
• 2.1.2 方法48-60
• 第3章 結(jié)果與分析60-96
• 3.1 flg22誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的肽前體基因的鑒定60-61
• 3.2 flg22誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的分泌肽前體蛋白序列分析61-64
• 3.3 prePIP1的亞細(xì)胞定位及體外蛋白切割分析64-68
• 3.4 prePIP1的表達(dá)分析68-70
• 3.5 PIP1抑制擬南芥根生長(zhǎng)70-72
• 3.6 PIP1誘導(dǎo)免疫反應(yīng)發(fā)生和增強(qiáng)擬南芥對(duì)Pst DC3000的抗性72-74
• 3.7 PrePIP1和prePIP2參與擬南芥根部免疫74-77
• 3.8 RLK7是PIP1的受體77-83
• 3.9 PIP1-RLK7信號(hào)依賴于BAK183
• 3.10 PIP1-RLK7信號(hào)不依賴于BIK183-85
• 3.11 PIP1-RLK7對(duì)PAMP flg22信號(hào)起放大作用85-87
• 3.12 PIP1調(diào)控的擬南芥轉(zhuǎn)錄組分析87-89
• 3.13 PIP1通過(guò)誘導(dǎo)SA信號(hào)參與植物免疫調(diào)節(jié)89-92
• 3.14 PIP1-RLK7調(diào)控SA依賴的flg22信號(hào)92-94
• 3.15 flg22和SA共同參與上調(diào)prePIP1表達(dá)94-96
• 第4章：結(jié)論96-98
• 第5章：討論與展望98-107
• 5.1 討論98-104
• 5.1.1 flg22誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的分泌肽前體基因98-99
• 5.1.2 prePIP1的成熟加工99-101
• 5.1.3 PIP1激活依賴于RLK7的免疫反應(yīng)和參與對(duì)病原菌的抗性101-102
• 5.1.4 PIP1-RLK7調(diào)控的植物免疫機(jī)制102-104
• 5.2 展望104-107
• 參考文獻(xiàn)107-123
• 附錄123-128
• 致謝128-129
• 附件129

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本文編號(hào)：564072