本文關鍵詞：擬南芥分泌肽PIP1調(diào)節(jié)植物免疫的分子機制

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【摘要】：病原微生物是影響植物生長發(fā)育和限制作物產(chǎn)量的主要威脅之一。因此,揭示植物免疫機制對于發(fā)展抗病、高產(chǎn)的現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)具有重要意義。已有研究表明,植物可以依靠細胞表面模式識別受體識別病原菌相關分子模式pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)啟動PAMPs-觸發(fā)免疫(PTI, PAMP-Triggered Immunity)。此外,植物還能夠通過細胞表面受體識別內(nèi)源信號分子,比如肽類、胞外ATP (e ATP),觸發(fā)PTI類似反應。水楊酸、乙烯等植物激素對PTI的調(diào)控發(fā)揮至關重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),一類新的植物激素——分泌肽在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和響應外界脅迫等生理進程中發(fā)揮重要的作用,然而它們參與植物免疫調(diào)節(jié)的分子機制尚未被深入研究。為了鑒定可能參與擬南芥PTI調(diào)節(jié)的植物肽信號,本研究通過分析PAMP flg22誘導的擬南芥轉錄組,鑒定了25個被flg22誘導上調(diào)表達的肽前體基因。其中,三個未知功能基因(At4g28469、At4g37290和At2g23270,分別命名為prePIP1、preP1P2和prePIP3)屬于同一基因家族。該家族基因進化上比較保守。同源比對分析顯示擬南芥至少具有11個該家族成員,在大豆、葡萄、玉米和水稻等其他多種單子葉植物和雙子葉植物中也具有其同源基因。序列分析顯示該家族蛋白為典型的分泌肽前體蛋白,其N端具有信號肽,C端具有-13氨基酸組成的保守區(qū),信號肽和保守區(qū)之間為序列保守性低的可變區(qū)。為了分析該基因家族可能的功能,我們對其代表成員prePIP1的轉錄調(diào)控、表達模式、細胞定位、功能位點進行了系統(tǒng)分析。結果顯示,病原菌Pseudomonas syingae、 Fusarium oxygenium、PAMPs flg22、幾丁質(zhì)和激素水楊酸能夠誘導prePIPl表達。通過對prePIP1p：：GFP轉基因擬南芥熒光顯微觀察,我們發(fā)現(xiàn)prePIP1主要在保衛(wèi)細胞、水孔、表皮毛和維管組織中表達。熒光顯微觀察瞬時表達prePIP1-GFP融合基因的煙草葉片顯示prePIP1定位于胞外。蛋白體外切割分析和質(zhì)譜分析顯示擬南芥胞外蛋白能夠在prePIP1 C端進行切割,并釋放C端保守區(qū)組成的肽。體外施加化學合成的prePIP1 C端13個氨基酸組成的多肽PIP1能夠模擬過表達prePIP1引起的擬南芥主根生長變短的表型,表明PIP1可能作為prePIP1的成熟肽發(fā)揮其生理功能。通過比較脯氨酸未羥基化和羥基化的PIP1對主根生長抑制的活性,我們還發(fā)現(xiàn)PIP1的第5個脯氨酸(Pro-5)羥基化能夠提高該多肽的根抑制活性。為了闡明PIP1的免疫相關作用機制,我們分析了該多肽的免疫誘導活性。通過prePIP1全長、N端信號肽或C末端保守區(qū)缺失基因分別與PTI標志基因FRK1啟動子啟動的螢光蟲熒光素酶基因(Luciferase, LUC)共轉化的擬南芥葉肉細胞原生質(zhì)體,并分析轉化原生質(zhì)體LUC活性,結果顯示原生質(zhì)體表達的prePIP1能夠激活FRK1表達依賴于其C末端保守區(qū)。對化學合成的Pro-5羥基化修飾的PIP 1多肽進行免疫誘導活性分析,結果顯示PIP1能夠誘導包括免疫基因表達、MAPK激活、ROS產(chǎn)生、氣孔關閉和胼胝質(zhì)沉積等免疫反應和增強擬南芥對病原細菌Pst DC3000的抗性。并且,過表達prePIP1和prePIP2能夠增強擬南芥對根寄生真菌Foc699的抗性。以上結果表明PIP1能夠激活PTI類似免疫反應和增強擬南芥對病原菌的抗性。為了鑒定PIP1的受體,我們分析了PIP1在部分受病原菌誘導表達的XI LRR-RLK基因突變體上的相關活性。結果顯示PIP1在rlk7突變體上不能抑制根生長和誘導免疫反應。通過生物素-推拉實驗、化學交聯(lián)和受體-配體結合分析證明RLK7為PIP1的受體。為了進一步揭示PIP1-RLK7介導的植物免疫信號機制,我們對比分析了PIP1-RLK7與PEP1-PEPR1的作用機制。結果顯示二者激活的早期免疫反應均依賴于BAK1,而只有PEP1-PEPR1信號依賴于BIK1。并且,兩個信號通路之間存在協(xié)同作用,二者共同參與對擬南芥PTI的放大。此外,我們還分析了PIP1誘導的擬南芥轉錄組。結果顯示PIP1能夠上調(diào)與flg22、PEP1類似的早期免疫相關基因表達。由于PIP1和flg22共同誘導上調(diào)表達的基因顯著富集BTH(SA功能類似物)誘導表達基因,RLK7突變顯著降低了flg22誘導的SA信號通路相關基因表達。并且,prePIP1過表達能夠促進flg22和SA誘導的PR1表達和對病原菌Pst DC3000的抗性,相反RLK7突變減弱了flg22和SA誘導的PRl表達和對病原菌DC3000的抗性。以上結果表明PIP1-RLK7能夠通過激活SA信號增強flg22信號。此外,我們還發(fā)現(xiàn)SA信號能夠促進flg22對prePIP1的誘導表達,而JA信號抑制了對prePIP1的誘導表達。因此,PIP1-RLK7信號和SA信號通過形成正反饋回路來放大flg22誘導的免疫信號。綜上所述,我們在擬南芥中鑒定了一類新的分泌肽PIP1及其受體RLK7。并且,我們證明PIP1-RLK7通過與SA激素信號形成正反饋回路放大flg22誘導的PTI信號。
【關鍵詞】：植物免疫 分泌肽 受體激酶 水楊酸
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S432.2
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第1章 文獻綜述11-45
• 1.1 植物免疫系統(tǒng)11-13
• 1.2 PAMPs和PTI激活13-20
• 1.3 植物內(nèi)源免疫激發(fā)子20-25
• 1.4 植物分泌肽參與的免疫調(diào)節(jié)25-28
• 1.5 類受體激酶(Receptor-like kinases,RLKs)28-35
• 1.6 PRRs介導的植物免疫激活及信號轉導35-43
• 1.7 研究目的和主要研究內(nèi)容43-45
• 1.7.1 研究目的43-44
• 1.7.2 主要研究內(nèi)容44-45
• 第2章 實驗材料與方法45-60
• 2.1 材料與方法45-60
• 2.1.1 材料和試劑45-48
• 2.1.2 方法48-60
• 第3章 結果與分析60-96
• 3.1 flg22誘導上調(diào)表達的肽前體基因的鑒定60-61
• 3.2 flg22誘導上調(diào)表達的分泌肽前體蛋白序列分析61-64
• 3.3 prePIP1的亞細胞定位及體外蛋白切割分析64-68
• 3.4 prePIP1的表達分析68-70
• 3.5 PIP1抑制擬南芥根生長70-72
• 3.6 PIP1誘導免疫反應發(fā)生和增強擬南芥對Pst DC3000的抗性72-74
• 3.7 PrePIP1和prePIP2參與擬南芥根部免疫74-77
• 3.8 RLK7是PIP1的受體77-83
• 3.9 PIP1-RLK7信號依賴于BAK183
• 3.10 PIP1-RLK7信號不依賴于BIK183-85
• 3.11 PIP1-RLK7對PAMP flg22信號起放大作用85-87
• 3.12 PIP1調(diào)控的擬南芥轉錄組分析87-89
• 3.13 PIP1通過誘導SA信號參與植物免疫調(diào)節(jié)89-92
• 3.14 PIP1-RLK7調(diào)控SA依賴的flg22信號92-94
• 3.15 flg22和SA共同參與上調(diào)prePIP1表達94-96
• 第4章：結論96-98
• 第5章：討論與展望98-107
• 5.1 討論98-104
• 5.1.1 flg22誘導上調(diào)表達的分泌肽前體基因98-99
• 5.1.2 prePIP1的成熟加工99-101
• 5.1.3 PIP1激活依賴于RLK7的免疫反應和參與對病原菌的抗性101-102
• 5.1.4 PIP1-RLK7調(diào)控的植物免疫機制102-104
• 5.2 展望104-107
• 參考文獻107-123
• 附錄123-128
• 致謝128-129
• 附件129

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本文編號：564072