本文關(guān)鍵詞：鐮刀菌和黃曲霉菌生防菌的分離及拮抗機(jī)理研究

  更多相關(guān)文章： 鐮刀菌 黃曲霉菌 生物防治 芽孢桿菌 依枯草菌素 豐原素 海藻希瓦氏菌 二甲基三硫

【摘要】：鐮刀菌和黃曲霉菌是世界上侵染小麥、玉米、水稻、花生等多種糧食和油料作物的病原真菌,不僅降低作物品質(zhì)和產(chǎn)量,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,還在侵染植物過(guò)程中產(chǎn)生多種真菌毒素,人、畜誤食后會(huì)引起中毒,嚴(yán)重時(shí)可致癌癥和死亡。中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó),糧食的生產(chǎn)和品質(zhì)關(guān)系著國(guó)家的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定。因此,開(kāi)展鐮刀菌和黃曲霉菌控制技術(shù)研究,對(duì)于保障我國(guó)糧食穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)和食品安全,具有重要意義。由于天然抗性資源匱乏,已鑒定和開(kāi)發(fā)的抗病資源有限,傳統(tǒng)育種方法未能有效控制這些病原菌及其毒素的危害。長(zhǎng)期以來(lái),鐮刀菌和黃曲霉菌的防治以化學(xué)殺菌劑為主,導(dǎo)致了嚴(yán)重的環(huán)境污染和生態(tài)環(huán)境問(wèn)題,誘發(fā)了病原菌的抗藥性和產(chǎn)毒量的增強(qiáng)。所以,開(kāi)發(fā)對(duì)生態(tài)和環(huán)境安全的生物防治技術(shù),具有廣泛的應(yīng)用前景。為此,我們分別以禾谷鐮刀菌和黃曲霉菌為靶標(biāo)病原真菌,通過(guò)微生物源生防菌株的分離、篩選、代謝物解析以及作用機(jī)理研究,獲得多個(gè)高活性拮抗菌,鑒定了主要抑菌物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用靶點(diǎn),并用于田間及儲(chǔ)藏期的病原菌防治。以鐮刀菌為靶標(biāo)病原菌取得的主要研究結(jié)果如下:1.抑制鐮刀菌的芽孢桿菌篩選。從中國(guó)9個(gè)省的不同生態(tài)環(huán)境中采集樣品160份,分離得到1809個(gè)菌株,其中12個(gè)菌株能顯著抑制禾谷鐮刀菌生長(zhǎng),進(jìn)一步用于孢子萌發(fā)、苗期接種、田間單花接種和噴霧接種等拮抗作用分析,最終獲得具有高效抑菌活性的3株芽孢桿菌(S76-3,DM-3,DK-1),其孢子萌發(fā)抑制率97%,小麥苗腐病抑制率為46%-57%,小麥穗腐病的抑制率為67%-80%。篩選得到的高效菌株S76-3用于鐮刀菌的田間防治和抑菌機(jī)理研究;2.拮抗菌及其無(wú)菌上清液抑菌活性測(cè)定。以抑菌活性最強(qiáng)的解淀粉芽孢桿菌S76-3為材料,以活菌數(shù)為指標(biāo)優(yōu)化發(fā)酵條件,篩選得到一個(gè)最優(yōu)培養(yǎng)基(紅糖23.3g/L,豆粉11.1 g/L,Ca CO3 4.9 g/L,KNO3 8 g/L,KH2PO4 0.5g/L,K2HPO4 1.2 g/L,Mg SO4·7H2O 5 g/L,Na Cl 3 g/L),發(fā)酵后活菌數(shù)達(dá)1010/ml以上;收集發(fā)酵液菌體,添加助劑后制備可濕性粉劑,活菌數(shù)達(dá)109/g以上。S76-3可濕性粉劑與無(wú)菌上清液稀釋后的田間試驗(yàn)表明,S76-3菌體和無(wú)菌上清液在不同年份和品種中均可有效防治小麥赤霉病,以2013年為例,無(wú)菌上清液處理后的病情指數(shù)可降低52%,小麥籽粒毒素含量降低76%,顯著優(yōu)于常用化學(xué)殺菌劑多菌靈;S76-3菌體處理可降低13%的病情指數(shù)的,43%的毒素,明顯弱于多菌靈;3.抑菌物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)解析。S76-3菌株基因組測(cè)序結(jié)合PCR分析表明,該菌株含有脂肽類物質(zhì)編碼基因;薄層色譜和液相色譜質(zhì)譜連用儀分析證實(shí),S76-3菌株主要產(chǎn)生依枯草菌素、豐原素和表面活性素;進(jìn)一步將這3種物質(zhì)經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離和質(zhì)譜分析(ESI-CID-MS)表明,S76-3產(chǎn)生的脂肽物質(zhì)為依枯草菌素A、豐原素A/B和表面活性素,每類物質(zhì)分別含有2-4種同系物;4.脂肽類物質(zhì)抑菌機(jī)理。利用高效液相收集上述3種脂肽物質(zhì),配置成不同濃度后用于體外抑制鐮刀菌活性以及抑菌機(jī)理研究,結(jié)果表明,表面活性素不具有抑菌活性,依枯草菌素A和豐原素A可高效抑菌鐮刀菌;光學(xué)顯微鏡分析表明,這2種物質(zhì)均可破壞鐮刀菌菌絲和孢子結(jié)構(gòu),導(dǎo)致真菌細(xì)胞膨大后喪失活性;透射電鏡分析顯示,這2種物質(zhì)主要引起真菌細(xì)胞壁穿孔和細(xì)胞膜破裂,導(dǎo)致細(xì)胞死亡;實(shí)時(shí)顯微跟蹤分析表明,依枯草菌素A主要作用于真菌菌絲的側(cè)端導(dǎo)致凸起,豐原素主要作用于菌絲生長(zhǎng)點(diǎn),使其異常膨大。以黃曲霉菌為靶標(biāo)病原菌取得的主要研究結(jié)果如下:1.產(chǎn)氣拮抗菌篩選與鑒定。從100余株海洋細(xì)菌中,通過(guò)雙皿對(duì)扣抑菌試驗(yàn),篩選獲得可產(chǎn)生抑菌性揮發(fā)氣體、對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制率高于80%的細(xì)菌5株,包括1株假單胞菌(Pseudomonas sp.)、1株希瓦氏菌YM8(Shewanella sp.)、2株葡萄球菌(Staphylococcus sp.)和1株微球菌(Micrococcus sp.),其中海藻希瓦氏菌YM8的抑菌活性最強(qiáng),對(duì)黃曲霉菌、鐮刀菌等9種重要植物病原真菌的抑制率均為100%。以海藻希瓦氏菌YM8為材料進(jìn)行儲(chǔ)藏期黃曲霉菌及其毒素防治和抑菌機(jī)理研究;2.抑菌氣體的化學(xué)結(jié)構(gòu)解析。利用氣相色譜質(zhì)譜連用儀(GC-MS)對(duì)YM8產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體物質(zhì)進(jìn)行分析,結(jié)果表明,YM8可產(chǎn)生15種揮發(fā)性物質(zhì),包括芳香族,烷類,硫化物,烯醇類,VA唑類,蒽類,酯類以及酚類等8類物質(zhì),其中二甲基三硫豐度最高,相對(duì)含量達(dá)14.195%。從15種物質(zhì)中選取相似度高于70%,相對(duì)含量高于0.5%的6種物質(zhì)進(jìn)行抑菌試驗(yàn),結(jié)果表明,2,4-二叔丁基苯酚和二甲基三硫的抑菌作用最強(qiáng),分別在濃度為100μg/L和200μg/L(物質(zhì)重量/空間體積)時(shí)可完全抑制黃曲霉菌絲的生長(zhǎng)和孢子萌發(fā);其余4種物質(zhì),2,4-二甲基VA唑、2-十二烷醇、丁基羥基甲苯和壬烷也具有抑制黃曲霉菌的作用。其中2,4-二甲基VA唑和2-十二烷醇為首次報(bào)道對(duì)病原真菌具有抑制作用。豐度最高、抑菌活性最強(qiáng)的二甲基三硫,在YM8菌株的抑菌活性中具有重要作用;3.產(chǎn)氣菌對(duì)糧食中黃曲霉抑菌效率分析。將YM8菌與接種黃曲霉孢子的花生、玉米籽粒共培養(yǎng)后檢測(cè)結(jié)果表明,對(duì)照組樣品中水活度越高發(fā)病率越高,毒素含量越大。高水活度下花生樣品發(fā)病率為100%,毒素含量為54μg/g,玉米樣品發(fā)病率為100%,毒素量為5.59μg/g,與此相比,YM8菌株可完全抑制花生、玉米籽粒黃曲霉菌生長(zhǎng)和毒素合成,在3種水活度下的黃曲霉菌與產(chǎn)毒量均為0。掃描電子顯微鏡觀察,未經(jīng)YM8處理的花生,表面覆蓋大量黃曲霉菌絲和孢子;而YM8處理組的花生表面,孢子不能萌發(fā),沒(méi)有菌絲及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu),少量異常孢子形狀畸形,表面干癟皺縮,失去侵染和萌發(fā)能力;4.YM8序列測(cè)定及BAC文庫(kù)構(gòu)建。YM8全基因組測(cè)序結(jié)果表明,該菌株基因組大小為4-5 M bp;提取YM8菌株DNA構(gòu)建大腸桿菌BAC文庫(kù),獲得含有1152個(gè)克隆(片段長(zhǎng)度為60 kb左右)的BAC文庫(kù)用于后續(xù)克隆二甲基三硫編碼基因。YM8菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中抑菌作用較弱,通過(guò)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同氨基酸,發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸和半胱氨酸能顯著提高抑菌活性,說(shuō)明這2種含硫氨基酸為合成二甲基三硫的關(guān)鍵物質(zhì),可能參與二甲基三硫的代謝合成途徑。
【關(guān)鍵詞】：鐮刀菌 黃曲霉菌 生物防治 芽孢桿菌 依枯草菌素 豐原素 海藻希瓦氏菌 二甲基三硫
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S476.1
【目錄】：

• 摘要9-12
• ABSTRACT12-16
• 縮略詞表16-17
• 第一章：田間小麥赤霉病的生防菌株篩選與抑菌機(jī)理研究17-88
• 1 文獻(xiàn)綜述17-35
• 1.1 鐮刀菌的種類和病害循環(huán)18-19
• 1.1.1 鐮刀菌的種類與分布18
• 1.1.2 鐮刀菌的病害循環(huán)18-19
• 1.2 鐮刀菌的危害19-21
• 1.2.1 對(duì)作物產(chǎn)量的影響19-20
• 1.2.2 對(duì)作物品質(zhì)的影響20
• 1.2.3 對(duì)人畜健康的危害20-21
• 1.3 鐮刀菌毒素21-23
• 1.3.1 鐮刀菌毒素的種類21-22
• 1.3.2 鐮刀菌毒素的危害22-23
• 1.4 小麥赤霉病與毒素的防治23-27
• 1.4.1 田間耕作防除23-24
• 1.4.2 培育抗病品種24-25
• 1.4.3 化學(xué)防治25-26
• 1.4.4 生物防治26-27
• 1.5 赤霉病的微生物源生物防治27-30
• 1.5.1 生防芽孢桿菌27-28
• 1.5.2 生防假單胞菌28-29
• 1.5.3 生防放線菌29
• 1.5.4 生防木霉與酵母菌29-30
• 1.6 芽孢桿菌對(duì)鐮刀菌的抑菌機(jī)理30-35
• 1.6.1 表面活性素31-32
• 1.6.2 依枯草菌素32-33
• 1.6.3 豐原素33-35
• 2 研究目的與意義35-36
• 3 材料和方法36-54
• 3.1 試驗(yàn)材料36-40
• 3.1.1 真菌菌株36
• 3.1.2 細(xì)菌菌株36
• 3.1.3 植物材料36
• 3.1.4 化學(xué)藥品與試劑36-37
• 3.1.5 主要培養(yǎng)基配置37-40
• 3.1.6 儀器設(shè)備40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法40-54
• 3.2.1 小麥赤霉病拮抗菌株的分離40-41
• 3.2.2 高效生防菌株的篩選41-44
• 3.2.3 篩選生防株S76-3 的田間防效44-46
• 3.2.4 菌株S76-3 的廣譜抑菌作用46
• 3.2.5 生防菌S76-3 的形態(tài)學(xué)鑒定46
• 3.2.6 生防菌S76-3 的分子生物學(xué)分析46-49
• 3.2.7 生理生化鑒定49
• 3.2.8 生防菌S76-3 基因組測(cè)序49-51
• 3.2.9 S76-3 產(chǎn)脂肽類物質(zhì)提取51
• 3.2.10 S76-3 產(chǎn)脂肽類物質(zhì)TLC檢測(cè)51-52
• 3.2.11 S76-3 產(chǎn)脂肽類物質(zhì)液相色譜檢測(cè)52
• 3.2.12 S76-3 產(chǎn)脂肽類物質(zhì)質(zhì)譜檢測(cè)52
• 3.2.13 依枯草菌素A和豐原素A的最低抑菌濃度52-53
• 3.2.14 依枯草菌素A與豐原素A對(duì)菌絲與孢子的顯微觀察53
• 3.2.15 依枯草菌素A與豐原素A對(duì)菌絲與孢子的電鏡觀察53-54
• 4 結(jié)果與分析54-83
• 4.1 小麥赤霉病拮抗菌株的篩選54-59
• 4.1.1 小麥赤霉病拮抗菌株的分離與初步鑒定54-55
• 4.1.2 篩選拮抗菌對(duì)鐮刀菌菌絲和孢子的抑制作用55-56
• 4.1.3 篩選拮抗菌對(duì)小麥苗腐病的抑制作用56-57
• 4.1.4 小麥赤霉病拮抗菌的田間單花接種57-59
• 4.2 生防菌S76-3 的生防效果59-63
• 4.2.1 生防菌S76-3 發(fā)酵上清的最低抑菌試驗(yàn)59
• 4.2.2 生防菌S76-3 可濕性粉劑制備59-60
• 4.2.3 生防菌S76-3 的田間小區(qū)試驗(yàn)60-63
• 4.3 生防菌S76-3 的廣譜抑菌作用63-64
• 4.4 生防菌S76-3 鑒定64-65
• 4.5 解淀粉芽孢桿菌S76-3 代謝產(chǎn)物鑒定65-77
• 4.5.1 菌株S76-3 基因組分析65-68
• 4.5.2 菌株S76-3 脂肽類物質(zhì)編碼基因克隆68
• 4.5.3 菌株S76-3 脂肽類物質(zhì)薄層色譜檢測(cè)68-69
• 4.5.4 菌株S76-3 脂肽類物質(zhì)液相色譜檢測(cè)69-71
• 4.5.5 菌株S76-3 脂肽類物質(zhì)ESI-MS檢測(cè)71-73
• 4.5.6 菌株S76-3 脂肽類物質(zhì)ESI-CID-MS檢測(cè)73-77
• 4.6 解淀粉芽孢桿菌S76-3 抑菌機(jī)理研究77-83
• 4.6.1 依枯草菌素和豐原素的最低抑菌濃度77-79
• 4.6.2 依枯草菌素和豐原素對(duì)孢子與菌絲作用的顯微觀察79-80
• 4.6.3 依枯草菌素A和豐原素A對(duì)菌絲作用的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)80-81
• 4.6.4 依枯草菌素和豐原素對(duì)菌絲和孢子作用的電鏡觀察81-83
• 5 討論83-88
• 第二章 花生、玉米黃曲霉的生防菌株篩選與抑菌機(jī)理研究88-133
• 1 文獻(xiàn)綜述88-99
• 1.1 黃曲霉88-90
• 1.1.1 黃曲霉菌的特征與分布88
• 1.1.2 黃曲霉菌的病害循環(huán)與流行88-89
• 1.1.3 黃曲霉菌的危害89-90
• 1.2 黃曲霉毒素90-94
• 1.2.1 黃曲霉毒素的種類與分布90-92
• 1.2.2 黃曲霉毒素對(duì)人體和動(dòng)物的危害92-94
• 1.3 黃曲霉菌與毒素的防治94-99
• 1.3.1 培育抗病品種94
• 1.3.2 基因工程育種94-95
• 1.3.3 化學(xué)防治95-96
• 1.3.4 生物防治96-99
• 2 研究目的與意義99-100
• 3 材料和方法100-107
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料100-101
• 3.1.1 真菌菌株100
• 3.1.2 細(xì)菌菌株100
• 3.1.3 植物材料100
• 3.1.4 培養(yǎng)基和試劑100-101
• 3.1.5 儀器設(shè)備101
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法101-107
• 3.2.1 生防菌株YM8 的分離與鑒定101
• 3.2.2 生防菌株YM8 對(duì)黃曲霉的抑制作用101-102
• 3.2.3 活性碳對(duì)菌株YM8 抑菌作用的影響102-103
• 3.2.4 生防菌株YM8 揮發(fā)性代謝物質(zhì)的GC/MS檢測(cè)103
• 3.2.5 揮發(fā)性單物質(zhì)的抑菌作用103-104
• 3.2.6 菌株YM8 對(duì)花生和玉米黃曲霉的防治104-105
• 3.2.7 生防菌株YM8 處理后籽粒掃描電鏡觀察105
• 3.2.8 生防菌株YM8 的溫度適應(yīng)性105-106
• 3.2.9 生防菌株YM8 的廣譜抑菌作用106
• 3.2.10 生防菌株YM8 的基因組測(cè)序與功能分析106
• 3.2.11 生防菌株YM8 的Bac文庫(kù)構(gòu)建106-107
• 3.2.12 菌株YM8 構(gòu)建Bac文庫(kù)的篩選107
• 4 結(jié)果與分析107-128
• 4.1 產(chǎn)氣拮抗菌YM8 的鑒定107-108
• 4.2 拮抗菌YM8 對(duì)黃曲霉的抑菌作用108-110
• 4.2.1 YM8 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制作用108-109
• 4.2.2 YM8 對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用109
• 4.2.3 活性碳對(duì)YM8 抑制作用的影響109-110
• 4.3 YM8 產(chǎn)抑菌代謝物質(zhì)的鑒定110-115
• 4.3.1 YM8 產(chǎn)揮發(fā)性氣體的鑒定110-114
• 4.3.2 YM8 產(chǎn)揮發(fā)性氣體的抑菌作用114-115
• 4.4 YM8 對(duì)花生和玉米黃曲霉的抑制115-118
• 4.5 YM8 的廣譜抑菌作用118-119
• 4.6 YM8 不同溫度下的抑菌作用119-120
• 4.7 菌株YM8 二甲基三硫編碼基因克隆120-125
• 4.7.1 菌株YM8 產(chǎn)二甲基三硫底物篩選120-122
• 4.7.2 YM8 基因組二甲基三硫代謝通路預(yù)測(cè)122-125
• 4.8 菌株YM8 構(gòu)建Bac文庫(kù)的篩選125-128
• 4.8.1 YM8 基因組Bac文庫(kù)構(gòu)建125-127
• 4.8.2 Bac文庫(kù)產(chǎn)二甲基三硫克隆篩選127-128
• 5 討論128-132
• 6 展望132-133
• 參考文獻(xiàn)133-154
• 附錄154-156
• 致謝156-157

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：551833