本文關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜磷高效的蛋白組學(xué)與比較基因組學(xué)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：由于磷在土壤中的低溶解度和難移動性,使得其成為研究最廣的植物大量礦質(zhì)營養(yǎng)元素。油菜是我國重要的油料作物,其中甘藍(lán)型油菜占我國油菜種植面積的80%以上。甘藍(lán)型油菜需磷較多,對缺磷敏感,其栽培區(qū)又位于我國土壤磷缺乏或嚴(yán)重缺乏的地區(qū)。因此,研究甘藍(lán)型油菜適應(yīng)低磷脅迫的機(jī)制和磷營養(yǎng)高效的遺傳機(jī)理,對于甘藍(lán)型油菜磷吸收利用的遺傳改良和栽培調(diào)控,以提高磷肥利用率,具有重要的理論和實踐意義。本研究以課題組前期篩選出的磷高效基因型“鄂油長莢(Eyou Changjia)”和磷低效基因型“B104-2”為材料,應(yīng)用雙向電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜技術(shù),分離鑒定兩基因型根系、葉片中響應(yīng)長期低磷脅迫和短期無磷饑餓下的差異蛋白;同時,應(yīng)用Label-free技術(shù)對短期無磷饑餓下兩基因型根系質(zhì)膜蛋白進(jìn)行定量與鑒定,獲得一批響應(yīng)磷饑餓的差異質(zhì)膜蛋白。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合比較基因組學(xué)的方法,以課題組前期構(gòu)建的甘藍(lán)型油菜磷高效遺傳連鎖圖譜為參考圖譜,將差異蛋白定位到遺傳連鎖圖上,建立差異蛋白與磷高效相關(guān)QTLs的聯(lián)系,解析甘藍(lán)型油菜磷脅迫的生理適應(yīng)和耐受機(jī)制。獲得的主要研究結(jié)果如下:1、長期低磷脅迫下的蛋白質(zhì)組學(xué)分析以正常磷(200μM P)培養(yǎng)為對照,植株幼苗低磷(5μM P)脅迫18 d,然后轉(zhuǎn)為正常磷培養(yǎng)培養(yǎng)2 d及5 d,取不同時間點根系和葉片樣品,提取總蛋白進(jìn)行蛋白組學(xué)分析。設(shè)有四個分析組,共分離鑒定到84個蛋白豐度發(fā)生顯著改變的蛋白質(zhì)點,其中分析組A(“B104-2”根系蛋白)19個、分析組B(“Eyou Changjia”根系蛋白)24個、分析組C(“B104-2”葉片蛋白)20個、分析組D(“Eyou Changjia”葉片蛋白)21個。2、短期無磷饑餓下的蛋白質(zhì)組學(xué)分析以正常磷(200μM P)培養(yǎng)為對照,植株幼苗先在正常磷(200μM P)培養(yǎng)15d,然后轉(zhuǎn)到無磷(0μM P)營養(yǎng)液中饑餓培養(yǎng),分別在饑餓1 d、3 d和5 d時取根系和葉片樣品,提取總蛋白進(jìn)行蛋白組學(xué)分析。設(shè)有四個分析組,共分離鑒定了75個蛋白豐度發(fā)生顯著改變的蛋白,其中分析組E(“B104-2”根系蛋白)16個、分析組F(“Eyou Changjia”根系蛋白)24個、分析組G(“B104-2”葉片蛋白)17個、分析組H(“Eyou Changjia”葉片蛋白)18個。3、兩基因型中差異蛋白的功能分析磷缺乏下兩基因型中發(fā)生差異的蛋白主要涉及防御與脅迫反應(yīng)、碳水化合物與能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控、氨基酸及脂肪酸代謝、蛋白過程、細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分和功能未知蛋白。磷缺乏時8個分析組中防御與脅迫反應(yīng)的差異蛋白有43個,其中76.7%為上調(diào)蛋白,主要與抗氧化相關(guān)。與磷低效基因型“B104-2”相比,磷高效基因型“Eyou Changjia”能更有效的抑制超氧陰離子(O2·-)的產(chǎn)生,降低膜脂過氧化水平。因此較強(qiáng)的抗氧化能力是甘藍(lán)型油菜磷高效的機(jī)制之一。磷缺乏使得磷高效基因型中硫脂合蛋白sqd1上調(diào)以增加硫脂的合成替換細(xì)胞中的磷脂,為磷缺乏的細(xì)胞提供更多的磷。因而,細(xì)胞的膜脂重構(gòu)為甘藍(lán)型油菜磷高效的又一機(jī)制。磷缺乏也改變了兩基因型中的碳水化合物代謝,參與此過程的差異蛋白有37個。磷缺乏下,磷高效基因型“Eyou Changjia”誘導(dǎo)形成胞質(zhì)UDP-葡萄糖旁路代謝途徑以繞開糖酵解途徑中ATP和無機(jī)磷消耗大的途徑。4、質(zhì)膜純化體系的建立與質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)淺析通過比較分析5.8%-6.4%濃度下的葡聚糖-聚乙二醇兩相分配體系對甘藍(lán)型油菜根系質(zhì)膜純化的影響,建立了根系質(zhì)膜純化的技術(shù)體系:采用6.2%葡聚糖-聚乙二醇兩相體系可得到高純度(大約90%)且蛋白產(chǎn)量較高(大約6.5μg/g FW)的質(zhì)膜組分。使用該技術(shù)體系純化質(zhì)膜后,采用label-free法進(jìn)行質(zhì)膜蛋白組學(xué)研究,共分離鑒定了71個差異質(zhì)膜蛋白,磷高效基因型“Eyou Changjia”31個,磷低效基因型“B104-2”40個。按質(zhì)膜蛋白的功能及參與的生化過程將質(zhì)膜蛋白分為細(xì)胞骨架、細(xì)胞防御、轉(zhuǎn)運蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白修飾、蛋白合成與降解、代謝與能量轉(zhuǎn)化、功能未知蛋白。5、比較基因組學(xué)方法建立差異蛋白與QTLs的聯(lián)系利用比較基因組學(xué)的方法,將總蛋白中94個差異蛋白及35個質(zhì)膜差異蛋白成功定位到遺傳連鎖圖譜上,其中72個差異蛋白和30個質(zhì)膜差異蛋白定位于磷效率系數(shù)、磷含量、干物質(zhì)重等磷高效相關(guān)的QTLs置信區(qū)間內(nèi),建立了差異蛋白與QTLs之間的聯(lián)系,為分離克隆QTLs區(qū)間內(nèi)的基因提供基因信息。
【關(guān)鍵詞】：甘藍(lán)型油菜 磷高效 蛋白質(zhì)組學(xué) 比較基因組學(xué) 生理分子機(jī)制
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S565.4
【目錄】：

• 中文摘要9-11
• ABSTRACT11-14
• 縮略語表14-15
• 1 文獻(xiàn)綜述15-31
• 1.1 土壤磷分布狀況與利用現(xiàn)狀15-16
• 1.2 植物磷營養(yǎng)及其生理功能16-18
• 1.3 植物適應(yīng)低磷脅迫的機(jī)制18-22
• 1.3.1 形態(tài)學(xué)適應(yīng)18-19
• 1.3.2 根系分泌物對土壤磷的活化19-21
• 1.3.3 植物體內(nèi)磷的再利用21
• 1.3.4 植物適應(yīng)低磷脅迫的分子機(jī)理21-22
• 1.4 植物蛋白組學(xué)研究現(xiàn)狀22-29
• 1.4.1 蛋白質(zhì)組學(xué)概念及其發(fā)展22-23
• 1.4.2 蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究技術(shù)23-26
• 1.4.3 國內(nèi)外植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)狀26-28
• 1.4.4 甘藍(lán)型油菜蛋白質(zhì)組學(xué)研究現(xiàn)狀28-29
• 1.5 比較基因組學(xué)研究進(jìn)展29-31
• 2. 研究的意義、目的和內(nèi)容31-34
• 2.1 研究意義31
• 2.2 研究目的31-32
• 2.3 研究內(nèi)容32-33
• 2.4 技術(shù)路線33-34
• 3. 長期低磷脅迫下可溶性總蛋白的分離鑒定34-56
• 3.1 材料與方法34-39
• 3.1.1 試驗材料培養(yǎng)34
• 3.1.2 生物量及磷含量測定34-35
• 3.1.3 可溶性總蛋白的抽提與定量35-36
• 3.1.4 蛋白質(zhì)雙向電泳36-37
• 3.1.5 凝膠膠圖染色與圖像分析37-38
• 3.1.6 差異蛋白質(zhì)點切取與酶解38
• 3.1.7 質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)庫檢索38-39
• 3.2 結(jié)果與分析39-55
• 3.2.1 長期低磷脅迫對生物量及磷相關(guān)性狀的影響39-42
• 3.2.2 長期低磷脅迫下的雙向電泳圖譜分析42-44
• 3.2.3 長期低磷脅迫下差異蛋白質(zhì)譜鑒定44-55
• 3.3 討論55-56
• 4. 短期無磷饑餓下可溶性總蛋白的分離鑒定56-73
• 4.1 材料與方法56-57
• 4.1.1 試驗材料培養(yǎng)56
• 4.1.2 生物量及磷含量測定56
• 4.1.3 可溶性總蛋白的抽提與定量56-57
• 4.1.4 蛋白質(zhì)雙向電泳57
• 4.1.5 凝膠膠圖染色與圖像分析57
• 4.1.6 差異蛋白質(zhì)點切取與酶解57
• 4.1.7 質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)庫檢索57
• 4.2 結(jié)果與分析57-72
• 4.2.1 短期無磷饑餓對生物量及磷相關(guān)性狀的影響57-61
• 4.2.2 短期無磷饑餓下的雙向電泳圖譜分析61-62
• 4.2.3 短期無磷饑餓下差異蛋白質(zhì)譜鑒定62-72
• 4.3 討論72-73
• 5. 磷缺乏誘導(dǎo)的差異蛋白功能分析73-80
• 5.1 材料與方法73
• 5.1.1 試驗材料73
• 5.1.2 功能注釋與代謝圖譜構(gòu)建73
• 5.2 結(jié)果分析與討論73-80
• 5.2.1 不同磷效率基因型間差異蛋白的比較73-76
• 5.2.2 碳水化合物及能量代謝76-78
• 5.2.3 抗逆與防御反應(yīng)相關(guān)蛋白78-79
• 5.2.4 氨基酸及脂肪酸代謝、蛋白翻譯與降解79-80
• 6. 磷脅迫下抗氧化反應(yīng)的差異分析80-92
• 6.1 材料與方法80-83
• 6.1.1 試驗材料80
• 6.1.2 試驗設(shè)計80
• 6.1.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性測定80-81
• 6.1.4 過氧化氫酶（CAT）活性測定81
• 6.1.5 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性測定81
• 6.1.6 愈創(chuàng)木酚過氧化物酶（GPX）活性測定81
• 6.1.7 谷胱甘肽還原酶（GR）活性測定81-82
• 6.1.8 膜脂過氧化分析82
• 6.1.9 超氧陰離子（O_2）及過氧化氫（H_2O_2）測定82-83
• 6.2 結(jié)果與分析83-89
• 6.2.1 不同磷處理對根系和葉片的膜脂過氧化的影響83-84
• 6.2.2 不同磷處理對根系及葉片中O_2和H_2O_2 的影響84-85
• 6.2.3 短期無磷饑餓對抗氧化酶活性的影響85-87
• 6.2.4 長期低磷脅迫對抗氧化酶活性的影響87-89
• 6.4 討論89-92
• 7. 短期無磷饑餓處理下根系質(zhì)膜蛋白質(zhì)組學(xué)淺析92-112
• 7.1 材料與方法92-98
• 7.1.1 試驗材料培養(yǎng)92
• 7.1.2 生物量及磷含量測定92-93
• 7.1.3 傷流的測定93
• 7.1.4 質(zhì)膜的分離93-96
• 7.1.5 質(zhì)膜純度的檢測96-97
• 7.1.6 質(zhì)膜蛋白的提取與label-free鑒定97-98
• 7.2 結(jié)果與分析98-110
• 7.2.1 短期無磷饑餓下的生理性狀分析98-100
• 7.2.2 短期無磷饑餓下傷流液分析100-101
• 7.2.3 質(zhì)膜分離體系的優(yōu)化101-103
• 7.2.4 質(zhì)膜蛋白的分析103-110
• 7.3 討論110-112
• 8. 差異蛋白的圖譜定位112-127
• 8.1 材料與方法112-113
• 8.1.1 試驗材料112
• 8.1.2 比較基因組學(xué)作圖112-113
• 8.2 結(jié)果與分析113-125
• 8.2.1 2-DE 檢測的差異蛋白在遺傳圖譜上的定位113
• 8.2.2 Label-free檢測的差異蛋白在遺傳圖譜上的定位113-125
• 8.3 討論125-127
• 9.候選基因的表達(dá)分析127-133
• 9.1 材料與方法127-130
• 9.1.1 試驗材料127-128
• 9.1.2 RNA的提取及測定128-129
• 9.1.3 引物設(shè)計及q PCR129-130
• 9.1.4 數(shù)據(jù)分析130
• 9.2 結(jié)果與分析130-132
• 9.3 討論132-133
• 10.研究總結(jié)與展望133-136
• 10.1 研究總結(jié)133-134
• 10.2 本研究的主要創(chuàng)新點134-135
• 10.3 本研究不足之處135
• 10.4 研究展望135-136
• 參考文獻(xiàn)136-157
• 致謝157-158
• 作者簡介158
• 在讀期間發(fā)表論文158-159
• 會議摘要159-160

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：466770