本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒流行毒株糖蛋白E2高變區(qū)氨基酸置換對疫苗C株獲得性免疫應(yīng)答的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬瘟是具有高度傳染性的病毒性疾病,是養(yǎng)豬業(yè)危害最嚴重的疾病之一。其病原為豬瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV),該病毒為具有囊膜的正鏈RNA病毒,基因組長度大約12.3 kb,包含5’和3’端非翻譯區(qū),編碼一條含有3898個氨基酸的肽鏈,能夠被剪切為12個蛋白,其中4個為結(jié)構(gòu)蛋白(C、Erns、E1和E2)和8個為非結(jié)構(gòu)蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。在結(jié)構(gòu)蛋白中,E2被認為是CSFV的主要保護性抗原�；贓2基因的CSFV基因分型結(jié)果顯示,流行毒株已經(jīng)從基因型1轉(zhuǎn)變?yōu)榛蛐?,表明主要抗原基因正在逐步發(fā)生變異。有研究表明,E2蛋白單點氨基酸的突變可能影響E2蛋白的抗原性,進而改變E2蛋白與抗體反應(yīng)性,大部分影響中和反應(yīng)差異性的重要抗原特異性氨基酸殘基位于B/C抗原結(jié)構(gòu)域上。然而,有關(guān)E2基因變異是否影響CSFV弱毒疫苗的免疫效果鮮見研究。本研究試圖通過原核和桿狀病毒系統(tǒng)表達基于流行毒株E2高變區(qū)AR3的突變蛋白,系統(tǒng)分析它們與疫苗C株高免血清的反應(yīng)性及其對C株免疫豬外周血單核細胞的激活效應(yīng),以此闡明流行毒株E2蛋白變異對C株疫苗免疫效果的潛在影響。原核表達屬于基因2型CSFV流行毒株QZ-07與HZ1-08的E2抗原結(jié)構(gòu)域(AD和BC區(qū)),與疫苗C株免疫的豬血清反應(yīng)性顯著低于相同區(qū)域的C株E2片段(P0.05)。通過基因1型和2型E2蛋白分析發(fā)現(xiàn),E2抗原結(jié)構(gòu)域包含3個高變抗原區(qū)(Antigenic region, AR)。我們通過對商業(yè)的桿狀病毒表達系統(tǒng)進行改造,制備了疫苗C株、流行毒株QZ-07和HZl-08不包含跨膜區(qū)的截短E2蛋白,以及以C株E2為骨架分別嵌合流行毒株3個AR區(qū)的重組嵌合蛋白。ELISA和免疫印跡分析結(jié)果顯示,C株E2嵌合流行毒株AR3的重組蛋白在所有重組嵌合蛋白中反應(yīng)性最差(P0.05)。另外,為了檢驗流行毒株E2不同抗原區(qū)對C株疫苗免疫產(chǎn)生的細胞介導免疫影響,我們用不同的重組E2蛋白刺激C株疫苗免疫的豬外周血單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。通過ELISPOT和流式細胞術(shù)分析,我們發(fā)現(xiàn)C株E2嵌合不同流行毒株抗原區(qū)的重組蛋白在刺激PBMC分泌抗體和分泌IFN-γ能力上沒有顯著的區(qū)別。上述結(jié)果表明,E2蛋白主要誘導體液免疫,C株疫苗血清與基因2型流行毒株的E2蛋白反應(yīng)性有顯著差別,這種差別可能主要來自于AR3的變異。為了進一步探索AR3的變異在E2蛋白與C株疫苗誘導的體液免疫之間的關(guān)系,我們選取了AR3區(qū)的10個差異顯著的氨基酸位點,利用桿狀病毒表達系統(tǒng)制備了以C株E2為骨架、分別攜帶流行毒株單一氨基酸置換的10個突變E2蛋白。免疫印跡結(jié)果顯示,不同突變蛋白之間及其與C株E2蛋白之間對C株血清的反應(yīng)性差異并不明顯。ELISA分析結(jié)果表明,相對于C株E2蛋白所有重組突變蛋白與C株免疫豬血清反應(yīng)能力都有降低,其中以E37N和V45Q(以AR3區(qū)域的氨基酸位置)反應(yīng)能力降低更為顯著(P0.05),表明這兩個氨基酸可能與E2蛋白的構(gòu)象相關(guān)。以上結(jié)果表明,基因型2的流行毒株E2蛋白抗原區(qū)變異影響其對C株疫苗的血清反應(yīng)性,其中以AR3區(qū)的影響尤為明顯；AR3區(qū)的E37N和V45Q兩個位點置換顯著降低其與C株高免血清的反應(yīng)性,表明這些氨基酸可能介導了E2蛋白的構(gòu)象變化。本研究結(jié)果為豬瘟疫苗的改良和基于E2蛋白亞單位疫苗的研制提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬瘟病毒 E2蛋白 抗原區(qū) 流行毒株
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.65
【目錄】：

• 摘要10-12
• ABSTRACT12-15
• 第一部分 文獻綜述15-37
• 第一章 豬瘟病毒的生物學特征及其編碼蛋白功能16-30
• 1 生物學特征16-18
• 2 流行情況18-20
• 3 病毒編碼蛋白功能20-30
• 3.1 結(jié)構(gòu)蛋白21-24
• 3.2 非結(jié)構(gòu)蛋白24-30
• 第二章30-36
• 2 E2亞單位疫苗及其保護效力30-32
• 3 影響E2亞單位疫苗免疫效力的因素32-34
• 3.1 E2蛋白變異32-34
• 3.2 母源抗體34
• 4 控制豬瘟病毒感染面臨的主要問題34-36
• 本研究的目的和意義36-37
• 第二部分 試驗研究37-87
• 第三章 桿狀病毒表達豬瘟病毒C株E2嵌合流行毒株E2高變區(qū)重組蛋白38-54
• 摘要38-39
• 1 材料39-40
• 1.1 菌株、細胞和培養(yǎng)條件39
• 1.2 主要試劑和儀器39-40
• 2 方法40-47
• 2.1 pFastBac~(TM)HT B載體改造40-41
• 2.2 攜帶E2基因的pFastHTB-M1重組質(zhì)粒構(gòu)建41-42
• 2.3 重組E2蛋白桿狀病毒基因組構(gòu)建42-43
• 2.4 表達E2蛋白的重組桿狀病毒制備43-44
• 2.5 重組E2蛋白純化44-45
• 2.6 SDS-PAGE/免疫印跡45-47
• 3 結(jié)果47-52
• 3.1 pFastBac~(TM)HT B改造載體鑒定47-48
• 3.2 攜帶E2基因pFastHTB-M1重組質(zhì)粒鑒定48-49
• 3.3 重組E2蛋白桿狀病毒基因組鑒定49-50
• 3.4 重組E2桿狀病毒制備50
• 3.5 重組E2蛋白純化與鑒定50-52
• 4 討論52-54
• 第四章 豬瘟病毒流行毒株E2抗原區(qū)對C株誘導的免疫反應(yīng)性影響54-68
• 摘要54-55
• 1 材料55
• 1.1 動物、細胞和養(yǎng)殖及培養(yǎng)條件55
• 1.2 主要試劑和儀器55
• 2 方法55-60
• 2.1 C株疫苗免疫血清及外周血單核細胞分離55-56
• 2.2 ELISA56-57
• 2.3 免疫印跡57
• 2.4 外周血單核細胞抗體分泌水平檢測57-58
• 2.5 外周血單核細胞IFN-γ分泌水平檢測58-60
• 3 結(jié)果60-66
• 3.1 攜帶流行毒株E2高變區(qū)重組蛋白與C株高免血清反應(yīng)性60-62
• 3.2 攜帶流行毒株E2高變區(qū)重組蛋白對PBMC抗體水平分泌的影響62-63
• 3.3 攜帶流行毒株E2高變區(qū)重組蛋白對PBMC分泌IFN-γ的影響63-66
• 4 討論66-68
• 第五章 豬瘟病毒C株E2置換流行毒株高變區(qū)差異氨基酸對C株免疫豬血清反應(yīng)性的影響68-87
• 摘要68
• 1 材料68-70
• 1.1 動物、毒株和細胞69
• 1.2 主要試劑和儀器69-70
• 2 方法70-78
• 2.1 流行毒株高變區(qū)AR3差異氨基酸位點分析70-72
• 2.2 基于C株E2的pFastHTB-M1-C-E2為骨架置換流行毒株高變區(qū)氨基酸72
• 2.3 置換流行毒株高變區(qū)氨基酸的重組E2蛋白桿狀病毒基因組構(gòu)建72-73
• 2.4 表達E2突變蛋白桿狀病毒的制備73
• 2.5 重組蛋白表達與純化73-76
• 2.6 突變蛋白與高免血清反應(yīng)性分析76-78
• 3 結(jié)果78-85
• 3.1 流行毒株高變區(qū)AR3變異顯著的氨基酸位點78-80
• 3.2 攜帶C株E2置換流行毒株AR3差異氨基酸的pFastHTB-M1載體鑒定80-82
• 3.3 突變C株E2基因的桿狀病毒基因組和重組病毒鑒定82
• 3.4 重組E2蛋白鑒定82-83
• 3.5 流行毒株高變區(qū)氨基酸置換對E2蛋白與高免血清反應(yīng)性的影響83-85
• 4 討論85-87
• 結(jié)論和創(chuàng)新性87-88
• 附圖88-93
• 參考文獻93-107
• 作者簡介107-108
• 致謝108

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王姝;朱遠茂;蔡紅;馬磊;史鴻飛;呂闖;董秀梅;高欲燃;薛飛;;牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白單克隆抗體的制備及初步鑒定[J];中國生物工程雜志;2013年04期

2 李嬌;薛飛;朱遠茂;祖立闖;;牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的截短表達與鑒定[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學報;2008年03期

3 高欲燃;朱遠茂;康健;史鴻飛;李嬌;任憲剛;馮軍科;于作;薛飛;;牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的多克隆抗體制備及鑒定[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學報;2011年03期

4 聶明非;李巖;溫凱;賈瑩;王君偉;;牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[J];中國預(yù)防獸醫(yī)學報;2010年07期

5 田宏;吳錦艷;尹雙輝;尚佑軍;鄭海學;劉湘濤;;豬瘟重組蛋白E2的兔體免疫保護試驗[J];華北農(nóng)學報;2009年S2期

6 鄧宇;藺濤;孫春清;張宏彪;張榮;龍進學;黃律;文心田;曹三杰;童光志;袁世山;鄭浩;;豬源牛病毒性腹瀉病毒SD0803株E2蛋白的表達及抗體制備[J];動物醫(yī)學進展;2012年04期

7 彭俊;萬艷平;;人乳頭瘤病毒E2蛋白對細胞增殖作用的研究進展[J];微生物學免疫學進展;2007年02期

8 李丹莉;張昌菊;;人乳頭瘤病毒E2蛋白及其相關(guān)疫苗[J];生命的化學;2007年05期

9 高璐璐;張思春;郭煥成;涂長春;;豬瘟病毒蛋白E2、N~(pro)基因的克隆表達及純化[J];中國獸醫(yī)學報;2012年08期

10 雷艷君;高晨;姜慧英;韓俊;陳建明;石琦;周偉;袁育康;董小平;;人乳頭瘤病毒2(HPV-2)變異株的突變E2蛋白轉(zhuǎn)錄抑制作用的研究[J];病毒學報;2008年04期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 高欲燃;朱遠茂;史鴻飛;任憲剛;馮軍科;于作;薛飛;;牛病毒性腹瀉病毒重組E2蛋白多克隆抗體的制備及鑒定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第八次學術(shù)研討會論文集[C];2010年

2 賀番;凌理軍;廖亞金;李素;韓文;趙碧波;孫元;仇華吉;;β-actin與豬瘟囊膜蛋白E2相互作用并參與病毒復制[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學術(shù)研討會論文集[C];2013年

3 李巖;賈瑩;溫凱;劉華;王君偉;;牛病毒性腹瀉病毒VEDEVAC株E2蛋白線性表位區(qū)的篩選[A];中國畜牧獸醫(yī)學會畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第八次學術(shù)研討會論文集[C];2010年

4 覃紹敏;白安斌;吳健敏;廖文軍;袁書智;華俊;關(guān)忠誼;;抗人紅細胞單鏈抗體與豬瘟E2蛋白雙功能融合 蛋白的構(gòu)建及生物學活性檢測[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術(shù)研討會論文集（上冊）[C];2009年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 楊嶺;豬瘟病毒流行毒株糖蛋白E2高變區(qū)氨基酸置換對疫苗C株獲得性免疫應(yīng)答的影響[D];浙江大學;2015年

2 任艷;牛病毒性腹瀉病毒囊膜蛋白E2與牛胚胎滋養(yǎng)層細胞相互作用的分子機制研究[D];石河子大學;2010年

3 賀番;基于偽型病毒的豬瘟中和抗體檢測方法的初步建立及豬瘟病毒E2蛋白的細胞定位研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學;2010年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李嬌;牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白的原核表達與巢式RT-PCR檢測方法的建立和應(yīng)用[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2008年

2 彭俊;人乳頭瘤病毒18型E2蛋白及其刪除突變體對Mφ分泌與凋亡的影響[D];南華大學;2008年

3 高欲燃;牛病毒性腹瀉病毒重組E2蛋白多克隆抗體制備及間接ELISA方法的建立與應(yīng)用[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2010年

4 胡剛?cè)~;重組豬瘟病毒E2桿狀病毒的構(gòu)建及其在蠶蛹中表達重組豬瘟E2蛋白[D];河南農(nóng)業(yè)大學;2012年

5 聶明非;牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白和NS3蛋白單克隆抗體的制備及鑒定[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2010年

6 陳杰;人乳頭瘤病毒16型E2蛋白對巨噬細胞分泌活性及凋亡的影響[D];南華大學;2011年

7 王姝;牛病毒性腹瀉病毒E2蛋白單克隆抗體的制備及IPMA方法的建立與初步應(yīng)用[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2013年

8 劉越;人乳頭瘤病毒16型E2蛋白與Daxx相互作用及作用的結(jié)構(gòu)域[D];南華大學;2013年

9 徐興然;牛病毒性腹瀉病病毒中國毒株E2基因的鑒定及表達E2蛋白的抗原性研究[D];中國人民解放軍軍需大學;2002年

10 代興國;重組E2蛋白在豬瘟的檢測及免疫方面的應(yīng)用研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2006年

  本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒流行毒株糖蛋白E2高變區(qū)氨基酸置換對疫苗C株獲得性免疫應(yīng)答的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：404485