本文關(guān)鍵詞：控制菌根共生效率玉米基因的定位與功能互補(bǔ)，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：玉米(Zea mays L.)不但是重要的糧食作物,還是重要的飼料來源、工業(yè)原料,在糧食供給和經(jīng)濟(jì)發(fā)展方面起著不可或缺的作用。叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是一種最常見的內(nèi)生菌根真菌,能與80%以上的陸地植物形成互惠共生體—叢枝菌根 (Arbuscular mycorrhiza, AM), AM不僅能夠促進(jìn)植物對(duì)水分和礦質(zhì)元素特別是P素的吸收,改善植物營養(yǎng)狀況,還能增強(qiáng)植物對(duì)生物和非生物脅迫的抗性,從而提高植物的產(chǎn)量和質(zhì)量。高共生效率是叢枝菌根共生體系的關(guān)鍵起始因素,目前國內(nèi)外對(duì)AMF與玉米間互作的研究集中在抗鹽、抗旱、抗重金屬污染等領(lǐng)域,而針對(duì)玉米同AMF共生效率的研究還未有報(bào)道,尚未從玉米遺傳種質(zhì)中鑒定出控制玉米同AMF共生效率的基因。隨著單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展,基于連鎖不平衡(LD)的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)為復(fù)雜數(shù)量性狀的研究開辟了新途徑。本研究利用380份玉米自交系,對(duì)玉米同AMF共生效率的性狀進(jìn)行了GWAS分析,定位到一個(gè)主效基因并對(duì)其進(jìn)行了功能驗(yàn)證,為進(jìn)一步利用基因資源開展分子標(biāo)記育種提供了研究目標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn),同番茄相比,玉米B73接種叢枝菌根真菌Rhizophagus irregularis也能夠建立良好的共生關(guān)系,根系侵染率達(dá)到50%。同促進(jìn)番茄生長類似,R. irregularis可顯著提高B73的莖長、地上部鮮重,同時(shí)提高B73對(duì)玉米紋枯病菌(Rhizoctonia solani Kiihn)的抗性。商品化玉米鄭單958和先玉335的R. irregularis根系侵染率都低于10%,盆栽實(shí)驗(yàn)和大田實(shí)驗(yàn)共同證實(shí),R. irregularis對(duì)鄭單958和先玉335的莖長、莖粗和玉米產(chǎn)量都無顯著影響。說明菌根真菌在玉米上的有效利用,首先需要從遺傳上改良共生效率。為鑒定玉米中影響玉米與叢枝菌根真菌共生關(guān)系的關(guān)鍵基因,我們選取了380份玉米自交系并接種R. irregularis,調(diào)查了共生效率。發(fā)現(xiàn)AMF在這些自交系中的侵染率分布為0%～100%,遺傳差異顯著。以侵染率作為遺傳表型,利用覆蓋全基因組的550000個(gè)SNP標(biāo)記,對(duì)其中數(shù)據(jù)完善的303份玉米材料的根系侵染率進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。通過比較四個(gè)模型GLM模型、Q模型、K模型和Q+K模型,發(fā)現(xiàn)Q模型最適合進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。在Q模型下,共檢測(cè)到27個(gè)顯著性SNPs,分布在位于第2、4、5、7號(hào)不同染色體上的5個(gè)基因(MSERG1～5,P1×10-4)上,這5個(gè)基因確定為控制玉米與R. irregularis共生效率相關(guān)基因的候選基因。以顯著性最高的MSERG 4基因?yàn)檠芯繉?duì)象,從玉米突變體庫中檢索到3個(gè)等位突變體,通過對(duì)鑒定的純合突變體進(jìn)行接種R. irregularis并分析共生效率,同野生型相比,MSERG 4-1, MSERG4-2和MSERG 4-3在接種R. irregularis后,根系A(chǔ)MF侵染率極顯著提高,從而證明MSERG 4基因與R. irregularis同與玉米的共生效率相關(guān)。進(jìn)一步的研究表明,突變體葉片中無機(jī)磷含量下降,莖中含量顯著升高,而根中則顯著降低。說明MSERG 4不僅能夠負(fù)調(diào)控玉米根系與AMF的共生關(guān)系,并能影響菌根玉米植株中無機(jī)磷的分布,這暗示MSERG 4很可能通過影響植物對(duì)無機(jī)磷的吸收來調(diào)控共生過程。由于AMF與作物共生具有廣譜性特點(diǎn),為探討MSERG 4基因參與調(diào)節(jié)共生效率的功能在不同物種中是否具有保守功能,我們通過同源比對(duì)的方法確定了水稻、煙草、番茄中的同源基因,并利用突變體或RNAi遺傳轉(zhuǎn)化的方法鑒定和創(chuàng)制了遺傳材料,為后期驗(yàn)證相關(guān)基因的功能積累了材料。
【關(guān)鍵詞】：玉米 叢枝菌根真菌 根系侵染率 全基因組關(guān)聯(lián)分析 候選基因
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S513
【目錄】：

• 中文摘要11-13
• Abstract13-15
• 1 前言15-43
• 1.1 AM真菌的簡(jiǎn)介15-16
• 1.2 AM真菌的分類16-17
• 1.3 AM真菌的培養(yǎng)方法17-20
• 1.3.1 盆栽培養(yǎng)法18
• 1.3.2 培養(yǎng)基培養(yǎng)法18
• 1.3.3 營養(yǎng)液培養(yǎng)法18
• 1.3.4 霧化培養(yǎng)法18
• 1.3.5 玻璃珠分室培養(yǎng)法18-19
• 1.3.6 大田培養(yǎng)法19
• 1.3.7 AM真菌與普通根雙重培養(yǎng)19
• 1.3.8 AM真菌與Ri-T-DNA轉(zhuǎn)型根的雙重單胞無菌培養(yǎng)法19
• 1.3.9 AM真菌與Ri-T-DNA轉(zhuǎn)型根雙重培養(yǎng)的改良分室單孢培養(yǎng)系統(tǒng)19-20
• 1.4 AM真菌的結(jié)構(gòu)20-22
• 1.5 AM共生過程22-27
• 1.5.1 信號(hào)分子22-23
• 1.5.2 共生過程23-25
• 1.5.3 菌根誘導(dǎo)的抗性25
• 1.5.4 叢枝的發(fā)育25-26
• 1.5.5 參與AM共生的植物基因的簡(jiǎn)介26-27
• 1.6 AM真菌與寄主植物間的相互作用27-36
• 1.6.1 AM真菌對(duì)植物糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響27-28
• 1.6.2 AM真菌對(duì)植物生長、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響28-29
• 1.6.3 AM真菌增強(qiáng)植物對(duì)礦質(zhì)元素的吸收29-31
• 1.6.4 AM真菌可提高植物的抗逆性31-33
• 1.6.5 AM真菌可提高植物的抗病性33-34
• 1.6.6 AM真菌與其他微生物的關(guān)系34-35
• 1.6.7 AM真菌可提高植物的抗重金屬能力35-36
• 1.7 植物激素與AM真菌的共生36-37
• 1.8 生態(tài)因素對(duì)AM真菌的影響37-38
• 1.8.1 土壤水份對(duì)AM真菌的影響37
• 1.8.2 土壤pH對(duì)AM真菌的影響37-38
• 1.8.3 土壤肥力對(duì)AM真菌的影響38
• 1.8.4 光照條件對(duì)AM真菌的影響38
• 1.8.5 溫度對(duì)AM真菌的影響38
• 1.8.6 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)對(duì)AM真菌的影響38
• 1.9 植物入侵對(duì)AM真菌的影響38-39
• 1.10 菌根的自我調(diào)控作用39-40
• 1.11 全基因組關(guān)聯(lián)分析40-41
• 1.12 本研究的目的和意義41-43
• 2 材料與方法43-52
• 2.1 供試植物材料43-45
• 2.2 菌株和載體45-46
• 2.3 盆栽種植46
• 2.3.1 番茄的盆栽種植46
• 2.3.2 玉米的盆栽種植46
• 2.4 大田試驗(yàn)46
• 2.5 臺(tái)盼藍(lán)染色46-47
• 2.6 AM真菌對(duì)植物根系侵染率的測(cè)定47
• 2.7 玉米紋枯病菌接種和病情分析47
• 2.8 全基因組關(guān)聯(lián)分析47
• 2.9 RNA的操作47
• 2.10 玉米突變體的鑒定47-48
• 2.11 水稻突變體的鑒定48
• 2.12 同源基因cDNA的獲得及表達(dá)載體的構(gòu)建48-50
• 2.13 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草和番茄的遺傳轉(zhuǎn)化50-51
• 2.13.1 煙草遺傳轉(zhuǎn)化程序50
• 2.13.2 番茄遺傳轉(zhuǎn)化程序50-51
• 2.14 轉(zhuǎn)基因煙草植株的陽性鑒定51
• 2.15 無機(jī)磷含量的測(cè)定51-52
• 3 結(jié)果與分析52-75
• 3.1 AM和AMF孢子的培養(yǎng)52
• 3.2 AM真菌對(duì)五種番茄的促生作用52-55
• 3.2.1 番茄與AM真菌的共生情況52-53
• 3.2.2 AM真菌對(duì)不同番茄品種農(nóng)藝性狀的影響53-55
• 3.3 AM真菌與玉米B73共生體系的建立55-56
• 3.3.1 玉米B73菌根的形態(tài)55
• 3.3.2 AM真菌對(duì)B73生長和紋枯病發(fā)生情況的影響55-56
• 3.4 AM真菌對(duì)商品化玉米品種的影響56-59
• 3.4.1 盆栽試驗(yàn)中AM真菌對(duì)商品化玉米品種生長的影響56-58
• 3.4.2 田間試驗(yàn)中AM真菌對(duì)商品化玉米品種的影響58-59
• 3.5 AMF與380份玉米自交系共生效率的調(diào)查59-63
• 3.6 全基因組關(guān)聯(lián)分析63-65
• 3.6.1 全基因組關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果63-65
• 3.6.2 候選基因功能預(yù)測(cè)65
• 3.7 玉米中基因MSERG 4的功能研究65-69
• 3.7.1 玉米突變體的鑒定65-66
• 3.7.2 玉米突變體AM真菌侵染率測(cè)定66-68
• 3.7.3 玉米突變體中無機(jī)磷含量的測(cè)定68-69
• 3.8 不同物種中MSERG 4同源基因的功能測(cè)試69-75
• 3.8.1 水稻中MSERG 4同源基因的功能研究69-70
• 3.8.2 煙草、番茄中MSERG 4同源基因功能研究70-75
• 3.8.2.1 同源基因cDNA的獲得和表達(dá)載體的構(gòu)建70-73
• 3.8.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化73-75
• 4 討論75-78
• 4.1 AM真菌對(duì)番茄和玉米B73生長和抗病性的影響75
• 4.2 玉米自交系A(chǔ)M真菌根系侵染率呈現(xiàn)多樣性75-76
• 4.3 AM真菌對(duì)先玉335和鄭單958玉米的促生效果不顯著76
• 4.4 基因MSERG 4在AM真菌與玉米共生過程中的作用76-77
• 4.5 不同物種間基因MSERG 4同源基因的功能研究77-78
• 5 結(jié)論78-79
• 5.1 AM真菌對(duì)番茄和玉米B73生長存在促進(jìn)作用78
• 5.2 玉米自交系根系侵染率呈現(xiàn)多樣性78
• 5.3 基因MSERG 4參與調(diào)控AM真菌與玉米的共生過程78-79
• 參考文獻(xiàn)79-101
• 致謝101-102
• 附錄102
• 附錄1：部分實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)操作程序102-104
• Protocol 1：植物總DNA小樣抽提法102
• Protocol 2：植物總RNA的提取102
• Protocol:3: Reverse Transcription for RT-PCR and quantitative RT-PCR102-103
• Protocol 4：熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5α)103
• Protocol 5：重組載體電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞103-104
• 附錄2：攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況104

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