本文關(guān)鍵詞：長牡蠣DNA甲基化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：表觀遺傳學(xué)是指在DNA序列不發(fā)生改變的情況下基因表達(dá)發(fā)生的可遺傳的改變,DNA甲基化是目前研究最為成熟的一種表觀遺傳修飾,與基因組防御、基因表達(dá)調(diào)控密切相關(guān)。目前DNA甲基化的研究主要集中在哺乳動物及植物中,水產(chǎn)動物的研究相對匱乏。長牡蠣{Crassostrea gigas)又名太平洋牡蠣,是我國乃至世界上產(chǎn)量最大的海產(chǎn)經(jīng)濟貝類,因其生活于環(huán)境多變的潮間帶并且具有復(fù)雜的生物學(xué)特征而成為水產(chǎn)動物研究的模式生物,對長牡蠣的DNA甲基化進(jìn)行研究有助于了解水產(chǎn)動物DNA甲基化的分子機制和功能,解析水產(chǎn)動物復(fù)雜生物學(xué)特征及對環(huán)境適應(yīng)性的調(diào)控機理。本研究針對長牡蠣開展了DNA甲基化的基礎(chǔ)研究,分析了DNA甲基化的遺傳模式、組織特異性及三倍體和選育群體中DNA甲基化的變異,以期為后期相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。1、長牡蠣DNA甲基化的遺傳模式采用熒光標(biāo)記的甲基化敏感擴增多態(tài)性(F-MSAP)方法,研究長牡蠣親本甲基化和非甲基化位點在子代的分離,檢測DNA甲基化在親子代間的遺傳模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn),長牡蠣90.6%的親本甲基化位點遵循孟德爾定律穩(wěn)定遺傳給子代,甲基化位點較非甲基化位點更加偏離孟德爾分離比,與親本相比,子代存在22個去甲基化位點,7個超甲基化位點和30個從頭甲基化位點。2、DNA甲基化在長牡蠣不同組織中的分化采用F-MSAP方法對10只野生長牡蠣6個組織(鰓、外套膜、閉殼肌、唇瓣、性腺、消化盲囊)的基因組甲基化進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),長牡蠣不同組織間DNA甲基化水平存在差異,消化盲囊、唇瓣、閉殼肌組織的甲基化水平較高,其中消化盲囊與鰓和外套膜組織的甲基化水平差異顯著,其他組織間差異并不顯著。長牡蠣中存在組織特異性和非組織特異性甲基化位點,然而由于牡蠣雜合度高,個體之間差異較大,未發(fā)現(xiàn)10個個體一致存在的組織特異性／非組織特異性甲基化位點。3、長牡蠣三倍體基因組DNA甲基化研究采用細(xì)胞松弛素B誘導(dǎo)產(chǎn)生長牡蠣二倍體和三倍體家系,采用F-MSAP方法對二倍體和三倍體的閉殼肌和性腺組織的DNA甲基化進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),二倍體與三倍體長牡蠣整體DNA甲基化水平在閉殼肌和性腺組織中都不存在差異,僅存在少量倍性特異性位點。通過與親本基因型比較發(fā)現(xiàn),三倍體的甲基化位點和未甲基化位點的變異率都高于二倍體。基于主成分分析方法對二倍體和三倍體的閉殼肌及性腺組織的表觀遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示,長牡蠣不同倍性及不同組織之間的表觀遺傳結(jié)構(gòu)存在較大差異,這暗示了二倍體與三倍體可能在某些甲基化位點存在差異,而不引起整體甲基化水平的變化。二倍體和三倍體長牡蠣中,都存在雄性特異性甲基化位點,未發(fā)現(xiàn)雌性中特有的甲基化位點。4、長牡蠣三倍體生殖相關(guān)基因表達(dá)與甲基化模式分析采用定量PCR對8個生殖相關(guān)基因在增值期和成熟期的二倍體和三倍體性腺組織的表達(dá)水平進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有增殖期的putative Vg基因和成熟期的caER基因在二倍體與三倍體中表達(dá)差異顯著。采用亞硫酸鹽處理測序方法對這兩個基因的啟動子及編碼區(qū)的CpG島甲基化情況進(jìn)行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Putative Vg基因啟動子及編碼區(qū)含有6個CpG島,但所有CpG島不存在胞嘧啶甲基化修飾,caER基因啟動子區(qū)域無CpG島,編碼區(qū)含有5個CpG島,位于第六外顯子和第十外顯子的CpG島存在甲基化修飾,其中第六外顯子CpG島胞嘧啶甲基化在二倍體和三倍體中不存在差異,而第十外顯子CpG島胞嘧啶甲基化在二倍體和三倍體中存在差異,可能與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)。5、長牡蠣人工選育群體DNA甲基化研究采用擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)方法和甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)方法對長牡蠣快生長品系“海大一號”基礎(chǔ)群體和選育群體的遺傳及表觀遺傳變異進(jìn)行分析。結(jié)果顯示基礎(chǔ)群體與選育群體總體DNA甲基化水平并無差異,然而對每個甲基化位點在兩個群體中出現(xiàn)頻率進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),82個甲基化位點中有9個位點在兩個群體中出現(xiàn)的頻率存在顯著差異。協(xié)慣量方差分析顯示表觀遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳結(jié)構(gòu)顯著相關(guān),但是部分個體具有相似的遺傳結(jié)構(gòu)卻表現(xiàn)出差異較大的表觀遺傳結(jié)構(gòu),選育群體的遺傳多樣性與表觀遺傳多樣性都略低于基礎(chǔ)群體。綜上所述,長牡蠣DNA甲基化的遺傳模式基本符合孟德爾遺傳定律,在不同組織、不同倍性及選育過程中會發(fā)生一定頻率的變異,這些變異有可能與基因差異表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：長牡蠣 DNA甲基化 遺傳 組織特異性 三倍體 人工選育
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述14-37
• 第一節(jié) 表觀遺傳學(xué)14-19
• 第二節(jié) DNA甲基化19-30
• 1 DNA甲基化的作用機制19-22
• 1.1 DNA甲基化的概念與特點19-20
• 1.2 DNA甲基化與去甲基化機制20-22
• 1.3 DNA甲基化調(diào)控基因表達(dá)的機制22
• 2 DNA甲基化的遺傳與變異22-25
• 2.1 DNA甲基化的遺傳22-23
• 2.2 DNA甲基化的變異23-25
• 3 DNA甲基化的生物學(xué)功能25-30
• 3.1 DNA甲基化與基因組防御26
• 3.2 DNA甲基化與發(fā)育分化26-27
• 3.3 DNA甲基化與基因印記27-28
• 3.4 DNA甲基化與X染色體失活28
• 3.5 DNA甲基化與疾病28-30
• 第三節(jié) DNA甲基化在水產(chǎn)動物中的研究進(jìn)展30-35
• 第四節(jié) 本研究的目標(biāo)和主要研究內(nèi)容35-37
• 1 研究目標(biāo)35
• 2 研究內(nèi)容35-37
• 2.1 長牡蠣DNA甲基化的遺傳模式35
• 2.2 長牡蠣DNA甲基化的組織特異性35-36
• 2.3 長牡蠣三倍體基因組DNA甲基化36
• 2.4 長牡蠣三倍體生殖相關(guān)基因表達(dá)與甲基化模式36
• 2.5 長牡蠣人工選育群體DNA甲基化變異36-37
• 第二章 長牡蠣DNA甲基化遺傳模式及組織特異性37-56
• 第一節(jié) DNA甲基化在長牡蠣親子代間的遺傳37-48
• 0 引言37-38
• 1 材料與方法38-43
• 1.1 實驗材料38
• 1.2 實驗方法38-41
• 1.3 數(shù)據(jù)分析41-43
• 2 結(jié)果43-45
• 2.1 長牡蠣親子代在CCGG位點的胞嘧啶甲基化水平43
• 2.2 長牡蠣親子代間DNA甲基化模式的遺傳與變異43-45
• 3 討論45-48
• 3.1 長牡蠣DNA甲基化模式分析45-46
• 3.2 長牡蠣DNA甲基化模式的遺傳與變異46-48
• 第二節(jié) DNA甲基化在長牡蠣不同組織中的分化48-56
• 0 引言48-49
• 1 材料和方法49-50
• 1.1 實驗材料49
• 1.2 實驗方法49-50
• 2 結(jié)果與分析50-53
• 2.1 不同組織基因組DNA甲基化水平分析50-51
• 2.2 組織特異性分析51-52
• 2.3 長牡蠣遺傳背景分析52-53
• 3 討論53-56
• 3.1 長牡蠣不同組織甲基化水平分析53-54
• 3.2 組織特異性甲基化功能分析54-56
• 第三章 長牡蠣三倍體DNA甲基化研究56-89
• 第一節(jié) 基于微衛(wèi)星標(biāo)記的長牡蠣三倍體鑒定56-64
• 0 引言56-57
• 1 材料與方法57-58
• 1.1 親貝獲取、受精、三倍體誘導(dǎo)及樣品采集57
• 1.2 DNA提取、PCR擴增及基因型分析57
• 1.3 流式細(xì)胞儀倍性鑒定57-58
• 2 結(jié)果58-61
• 2.1 微衛(wèi)星位點篩選及二倍體驗證58-59
• 2.2 微衛(wèi)星標(biāo)記及流式細(xì)胞儀方法倍性檢測結(jié)果分析59-60
• 2.3 倍性檢測所需微衛(wèi)星數(shù)目分析60-61
• 3 討論61-64
• 3.1 長牡蠣倍性檢測方法比較61-62
• 3.2 倍性檢測所需微衛(wèi)星位點數(shù)與微衛(wèi)星-著絲粒重組率關(guān)系62
• 3.3 無效等位基因62-64
• 第二節(jié) 長牡蠣三倍體基因組DNA甲基化F-MSAP分析64-74
• 0 引言64
• 1 材料與方法64-66
• 1.1 實驗材料64
• 1.2 實驗方法64-65
• 1.3 數(shù)據(jù)分析65-66
• 2 結(jié)果66-72
• 2.1 長牡蠣二倍體與三倍體整體DNA甲基化水平比較66-67
• 2.2 長牡蠣二倍體與三倍體的表觀遺傳結(jié)構(gòu)分析67-68
• 2.3 長牡蠣二倍體與三倍體親子間基因分離比較68-71
• 2.4 長牡蠣雄性特有甲基化位點71-72
• 3 討論72-74
• 3.1 長牡蠣多倍體化過程中的DNA甲基化變異72-73
• 3.2 長牡蠣性別決定與DNA甲基化73-74
• 第三節(jié) 長牡蠣三倍體生殖相關(guān)基因表達(dá)與甲基化水平分析74-89
• 0 引言74
• 1 材料與方法74-79
• 1.1 實驗材料74-75
• 1.2 實驗方法75-79
• 2 結(jié)果79-86
• 2.1 DNA和RNA的提取及質(zhì)量檢測79
• 2.2 目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率驗證79
• 2.3 二倍體與三倍體與三倍體長牡蠣生殖相關(guān)基因mRNA表達(dá)差異79-81
• 2.4 putative Vg、caER基因CpG富集區(qū)的DNA甲基化模式81-86
• 3 討論86-89
• 3.1 長牡蠣二倍體與三倍體差異表達(dá)基因分析86-88
• 3.2 DNA甲基化與基因表達(dá)分析88-89
• 第四章 長牡蠣人工選育群體DNA甲基化研究89-100
• 0 引言89
• 1 材料與方法89-92
• 1.1 實驗材料89-90
• 1.2 實驗方法90-91
• 1.3 數(shù)據(jù)分析91-92
• 2 結(jié)果92-98
• 2.1 AFLP分析92-93
• 2.2 MSAP分析93-96
• 2.3 表觀遺傳多樣性與遺傳多樣性相關(guān)性分析96-98
• 3 討論98-100
• 3.1 選育群體遺傳多樣性與變異98
• 3.2 人工選育過程中的DNA甲基化變異98-100
• 總結(jié)100-102
• 參考文獻(xiàn)102-127
• 致謝127-128
• 個人簡歷128-129
• 學(xué)術(shù)成果129

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