豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一種重要的人畜共患傳染病病原。主要感染10周齡的仔豬,能夠引起腦膜炎,敗血癥,肺炎,心內(nèi)膜炎和關(guān)節(jié)炎,在全球范圍內(nèi)造成重大的經(jīng)濟損失,僅在美國每年就損失超過3億美元。這種細菌不僅可以感染豬還可以感染其它哺乳動物和鳥類,在人群中S.suis可通過與感染的豬或豬肉副產(chǎn)品的密切接觸傳播給人類,并導致腦膜炎,關(guān)節(jié)炎,敗血癥和鏈球菌中毒樣休克綜合征(Streptococcus toxic shock like syndrome,STSLS)。自從1968年首次被報道人感染S.suis以來已經(jīng)成為一種危害公共健康的重要的人畜共患病。僅僅從2009年到2013年,人感染S.suis病例的總數(shù)從700多個增加到1642個,這表明人S.suis感染變得越來越普遍。該病原體是具有莢膜多糖(CPS)的革蘭氏陽性細菌,基于CPS抗原的不同,已經(jīng)鑒定了S.suis的29種血清型。其中,血清型2型(streptococcus suis serotype 2,SS2)發(fā)病最多且危害最為嚴重。在1998年和2005年,中國爆發(fā)了兩起大規(guī)模的人感染S.su...

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【學位級別】：博士

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摘要
Abstract
縮略詞表
第一章 文獻綜述
    1.1 豬鏈球菌病
    1.2 病原微生物學
    1.3 流行病學
    1.4 致病機制
        1.4.1 致病過程的階段
            1.4.1.1 宿主的粘膜和/或上皮表面的粘附與定植
            1.4.1.2 入侵深層組織并隨血液循環(huán)擴散
            1.4.1.3 穿過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)
            1.4.1.4 引起炎癥風暴
        1.4.2 免疫逃避的機制
            1.4.2.1 逃避補體介導的殺傷的機制
            1.4.2.2 逃避NET介導的殺傷機制
            1.4.2.3 其它一些逃避機制
    1.5 毒力相關(guān)因子
        1.5.1 莢膜(CPS)
        1.5.2 溶血素SLY
        1.5.3 轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)因子
            1.5.3.1 CcpA
            1.5.3.2 Rgg
            1.5.3.3 CovR
            1.5.3.4 RevS
            1.5.3.5 AdcR
            1.5.3.6 PerR
            1.5.3.7 雙元調(diào)控系統(tǒng)(TCS)
                1.5.3.7.1 Sal K/Sal R
                1.5.3.7.2 CiaRH
                1.5.3.7.3 Ihk/Irr
                1.5.3.7.4 Vir R/Vir S
                1.5.3.7.5 Nis K/Nis R
                1.5.3.7.6 1910HK/RR
                1.5.3.7.7 VraS/R
            1.5.3.8小RNAs(s RNAs)調(diào)控
    1.6 中毒樣休克綜合征(STSLS)
    1.7 本研究目的
第二章 豬鏈球菌毒力相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選
    2.1 前言
    2.2 材料
        2.2.1 菌種和質(zhì)粒
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 培養(yǎng)基和抗生素
        2.2.4 主要儀器設備
        2.2.5 試驗動物
    2.3 試驗方法
        2.3.1 細菌的培養(yǎng)
        2.3.2 體內(nèi)誘導實驗
            2.3.2.1 感染小鼠組織中SS2的分離
            2.3.2.2 RNA提取
            2.3.2.3 cDNA的合成
            2.3.2.4 實時熒光定量PCR
        2.3.3 菌株的構(gòu)建
        2.3.4 細菌生長曲線的測定
        2.3.5 細菌形態(tài)學觀察
            2.3.5.1 革蘭氏染色
            2.3.5.2 透射電鏡觀察
        2.3.6 突變體的小鼠感染實驗
        2.3.7 全血抑菌試驗
        2.3.8 體內(nèi)載菌量及血液細胞因子的測定
            2.3.8.1 體內(nèi)載菌量
            2.3.8.2 ELISA試劑盒檢測血漿中細胞因子濃度
        2.3.9 RNA-seq實驗
        2.3.10 RNA-seq結(jié)果的驗證
        2.3.11 統(tǒng)計分析
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 體內(nèi)誘導初步篩選差異表達轉(zhuǎn)錄因子
        2.4.2 各差異表達轉(zhuǎn)錄因子缺失突變體的構(gòu)建
        2.4.3 各基因缺失突變體生長曲線的測定
        2.4.4 透射電鏡觀察各基因缺失突變體的莢膜
        2.4.5 突變體小鼠感染實驗
        2.4.6 突變體在小鼠全血中的存活實驗
        2.4.7 突變體在小鼠體內(nèi)的載菌量實驗
        2.4.8 突變體誘導小鼠血液細胞因子的檢測
        2.4.9 轉(zhuǎn)錄因子缺失后的差異表達基因分析
        2.4.10 差異表達基因中的毒力相關(guān)基因的分析
    2.5 討論
        2.5.1 篩選到的毒力相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的命名
        2.5.2 轉(zhuǎn)錄因子、毒力和炎癥之間的關(guān)系
        2.5.3 ComR可能是一個毒力相關(guān)的全局調(diào)控因子
        2.5.4 Sit R和Svx R與豬鏈球菌的免疫逃避有密切關(guān)系
    2.6 小結(jié)
第三章 促炎蛋白HP1717促炎機理的研究
    3.1 前言
    3.2 材料
        3.2.1 菌株和質(zhì)粒
        3.2.2 主要試劑
        3.2.3 培養(yǎng)基和抗生素
        3.2.4 主要儀器設備
        3.2.5 主要緩沖液
        3.2.6 蛋白表達和純化相關(guān)試劑
        3.2.7 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western Blotting相關(guān)試劑
    3.3 試驗方法
        3.3.1 重組表達載體構(gòu)建
        3.3.2 蛋白表達與純化
            3.3.2.1 小量表達試驗
            3.3.2.2 重組蛋白蛋白大量表達和純化
            3.3.2.3 重組蛋白的透析和濃縮
        3.3.3 蛋白質(zhì)的定量
        3.3.4 重組蛋白去除內(nèi)毒素
        3.3.5 內(nèi)毒素的測定
        3.3.6 蛋白濃度測定
        3.3.7 ELISA和實時熒光定量PCR檢測重組蛋白的致炎性
            3.3.7.1 重組蛋白與RAW264.7共孵育
            3.3.7.2 RNA的提取
            3.3.7.3 cDNA的合成
            3.3.7.4 實時熒光定量PCR
        3.3.8 小鼠腹腔巨噬細胞的分離
        3.3.9 信號通路抑制試驗
        3.3.10 Western Blot技術(shù)驗證
        3.3.11 生長曲線的測定
        3.3.12 人工感染小鼠
            3.3.12.1 細菌計數(shù)
            3.3.12.2 體內(nèi)實驗
    3.4 結(jié)果與分析
        3.4.1 SSU05₁717保守性研究
        3.4.2 重組蛋白HP1717的原核表達
        3.4.3 HP1717對RAW264.7細胞促炎作用的檢測
        3.4.4 HP1717的促炎作用的劑量依賴性檢測
        3.4.5 HP1717活性對其促炎作用的影響
        3.4.6 HP1717刺激RAW264.7細胞后模式識別受體表達量檢測
        3.4.7 抗體抑制試驗檢測HP1717促炎作用的模式識別受體
        3.4.8 基因缺失小鼠試驗檢測HP1717促炎作用的模式識別受體
        3.4.9 信號通路抑制劑對促炎信號通路的檢測
        3.4.10 信號通路的磷酸化檢測
        3.4.11 突變體菌株Δ1717的構(gòu)建
        3.4.12 突變體菌株生長曲線的測定
        3.4.13 突變體菌株革蘭氏染色觀察
        3.4.14 突變體菌株的透射電鏡觀察
        3.4.15 突變體菌株在小鼠全血中的存活分析
        3.4.16 突變體菌株小鼠感染試驗
        3.4.17 突變體的體內(nèi)載菌量檢測
        3.4.18 突變體菌株體內(nèi)誘導炎癥因子的能力的檢測
    3.5 討論
        3.5.1 HP1717促炎作用的獨特性
        3.5.2 HP1717促炎機理是多條信號通路共同作用的結(jié)果
        3.5.3 Δ1717計數(shù)方法的獨特性
        3.5.4 CPS和炎癥對于毒力的影響
    3.6 小結(jié)
結(jié)論與展望
參考文獻
附錄
個人簡歷
致謝



本文編號：3831284