由膠孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡膠樹(shù)減產(chǎn)的主要原因之一。目前,關(guān)于橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌的致病機(jī)制的研究還十分有限。效應(yīng)蛋白是病原真菌的主要致病因子之一。通過(guò)生物信息學(xué)分析,我們預(yù)測(cè)到了一個(gè)編碼候選效應(yīng)蛋白的基因,將其命名為CgCP1,并對(duì)其進(jìn)行了鑒定和功能研究,主要結(jié)果如下:1、通過(guò)RT-PCR技術(shù)克隆了該基因的編碼區(qū)序列,測(cè)序結(jié)果表明編碼區(qū)序列含有一個(gè)678bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),編碼226個(gè)氨基酸的肽鏈。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,CgCPl蛋白是Cerato-platanin蛋白家族的一個(gè)分支,含有一個(gè)N末端信號(hào)肽序列(1-19aa),一個(gè)Cerato-platanin蛋白家族特有的Cerato-platanin保守結(jié)構(gòu)域(36-132aa)和一個(gè) C端保守的 13 肽基序(apopolysialoglycoprotein,ApoPSGP)。2、通過(guò)同源重組技術(shù)構(gòu)建了橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌CgCP1基因的敲除突變株ΔCgCP1 及互補(bǔ)株 Res-ACgCP1。3、通過(guò)對(duì)野生型菌株WT、ΔCgCP1和Res-ACgCP1的生長(zhǎng)情況和孢子產(chǎn)量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)WT、ΔCgCP1和Res-A...

【文章頁(yè)數(shù)】：82 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 橡膠樹(shù)及其病害
    1.2 橡膠樹(shù)炭疽病及其病原
    1.3 真菌的致病機(jī)制
        1.3.1 效應(yīng)蛋白在真菌致病機(jī)制中的作用
        1.3.2 黑色素在真菌致病機(jī)制中的作用
        1.3.3 活性氧在真菌致病機(jī)制中的作用
    1.4 Cerato-platanin效應(yīng)蛋白
    1.5 本研究的目的意義
    1.6 技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 植物材料、菌株、質(zhì)粒、試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)儀器
    2.3 橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌CgCP1基因生物信息學(xué)分析
    2.4 橡膠樹(shù)炭疽病菌基因組DNA和總RNA的提取
        2.4.1 橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌的DNA提取
        2.4.2 橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌的總RNA提取
    2.5 橡膠樹(shù)炭疽菌CgCP1基因的克隆
    2.6 載體的構(gòu)建
        2.6.1 敲除載體的構(gòu)建
        2.6.2 CgCP1互補(bǔ)載體的構(gòu)建
        2.6.3 原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)載體(pUC19-35S::CgCP1-FLAG)的構(gòu)建
        2.6.4 原生質(zhì)體亞細(xì)胞定位載體(pUC19-35s::CgCP1-GFP)的構(gòu)建
        2.6.5 植物表達(dá)載體(pEGAD-35s::CgCP1-GFP)的構(gòu)建
        2.6.6 植物表達(dá)載體提取質(zhì)粒
    2.7 橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌原生質(zhì)體的制備和轉(zhuǎn)化
    2.8 膠孢炭疽菌突變株的鑒定
    2.9 突變株的表型分析
    2.10 半定量檢測(cè)CgCP1基因表達(dá)量
    2.11 突變株機(jī)械穿透力實(shí)驗(yàn)
    2.12 突變株致病性分析
    2.13 炭疽菌侵染橡膠樹(shù)葉片活性氧檢測(cè)
    2.14 黑色素含量測(cè)定
    2.15 黑色素合成酶表達(dá)量分析
    2.16 CgCP1基因中的磷酸化位點(diǎn)點(diǎn)突變
        2.16.1 擴(kuò)增磷酸化位點(diǎn)突變的CgCP1基因
        2.16.2 CgCP1磷酸化位點(diǎn)突變互補(bǔ)載體的構(gòu)建
        2.16.3 磷酸化位點(diǎn)突變株的鑒定
        2.16.4 磷酸化位點(diǎn)突變株表型分析
    2.17 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
    2.18 農(nóng)桿菌注射煙草瞬時(shí)表達(dá)CgCP1
    2.19 煙草細(xì)胞壞死檢測(cè)
    2.20 橡膠樹(shù)葉片原生質(zhì)體制備
    2.21 橡膠樹(shù)原生質(zhì)體總蛋白的提取
    2.22 western blot檢測(cè)CgCP1蛋白表達(dá)
    2.23 橡膠樹(shù)原生質(zhì)體活性氧檢測(cè)
    2.24 CgCP1在橡膠樹(shù)原生質(zhì)體中的亞細(xì)胞定位
3 結(jié)果與分析
    3.1 膠孢炭疽菌Cerato-platanin蛋白基因CgCP1的生物信息學(xué)分析
    3.2 CgCP1敲除突變體菌株和互補(bǔ)菌株的鑒定
    3.3 CgCP1基因?qū)ιL(zhǎng)速率及產(chǎn)孢能力的影響
    3.4 CgCP1基因?qū)谏睾铣傻挠绊?br>    3.5 CgCP1蛋白的磷酸化對(duì)其功能的影響
    3.6 CgCP1影響膠孢炭疽菌對(duì)橡膠樹(shù)的致病力
    3.7 CgCP1對(duì)膠孢炭疽菌菌絲機(jī)械穿透力的影響
    3.8 CgCP1對(duì)植物先天免疫反應(yīng)的影響
        3.8.1 CgCP1誘導(dǎo)橡膠樹(shù)葉片活性氧的產(chǎn)生
        3.8.2 CgCP1對(duì)橡膠樹(shù)防衛(wèi)反應(yīng)基因HbPR1、HbPR5表達(dá)的影響
        3.8.3 CgCPl誘導(dǎo)煙草葉片壞死
    3.9 CgCP1在橡膠樹(shù)中的亞細(xì)胞定位
4 討論
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄Ⅰ 引物序列表
    附錄Ⅱ 原生質(zhì)體制備過(guò)程中各種試劑
    附錄Ⅲ 本實(shí)驗(yàn)所用儀器及器材
    附錄Ⅳ 培養(yǎng)基及其他試劑配方
    附錄Ⅴ 凝膠片段回收
    附錄Ⅵ 轉(zhuǎn)化反應(yīng)
    附錄Ⅶ 堿裂解法提取質(zhì)粒
    附錄Ⅷ 沉淀回收
攻讀博士學(xué)位期間已發(fā)表學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號(hào)：3802863