由膠孢炭疽菌引起的炭疽病害是造成海南省橡膠樹減產的主要原因之一。目前,關于橡膠樹膠孢炭疽菌的致病機制的研究還十分有限。效應蛋白是病原真菌的主要致病因子之一。通過生物信息學分析,我們預測到了一個編碼候選效應蛋白的基因,將其命名為CgCP1,并對其進行了鑒定和功能研究,主要結果如下:1、通過RT-PCR技術克隆了該基因的編碼區(qū)序列,測序結果表明編碼區(qū)序列含有一個678bp的開放閱讀框(ORF),編碼226個氨基酸的肽鏈。生物信息學分析結果顯示,CgCPl蛋白是Cerato-platanin蛋白家族的一個分支,含有一個N末端信號肽序列(1-19aa),一個Cerato-platanin蛋白家族特有的Cerato-platanin保守結構域(36-132aa)和一個 C端保守的 13 肽基序(apopolysialoglycoprotein,ApoPSGP)。2、通過同源重組技術構建了橡膠樹膠孢炭疽菌CgCP1基因的敲除突變株ΔCgCP1 及互補株 Res-ACgCP1。3、通過對野生型菌株WT、ΔCgCP1和Res-ACgCP1的生長情況和孢子產量進行分析,發(fā)現WT、ΔCgCP1和Res-A...

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 橡膠樹及其病害
    1.2 橡膠樹炭疽病及其病原
    1.3 真菌的致病機制
        1.3.1 效應蛋白在真菌致病機制中的作用
        1.3.2 黑色素在真菌致病機制中的作用
        1.3.3 活性氧在真菌致病機制中的作用
    1.4 Cerato-platanin效應蛋白
    1.5 本研究的目的意義
    1.6 技術路線
2 材料與方法
    2.1 植物材料、菌株、質粒、試劑
    2.2 實驗儀器
    2.3 橡膠樹膠孢炭疽菌CgCP1基因生物信息學分析
    2.4 橡膠樹炭疽病菌基因組DNA和總RNA的提取
        2.4.1 橡膠樹膠孢炭疽菌的DNA提取
        2.4.2 橡膠樹膠孢炭疽菌的總RNA提取
    2.5 橡膠樹炭疽菌CgCP1基因的克隆
    2.6 載體的構建
        2.6.1 敲除載體的構建
        2.6.2 CgCP1互補載體的構建
        2.6.3 原生質體瞬時表達載體(pUC19-35S::CgCP1-FLAG)的構建
        2.6.4 原生質體亞細胞定位載體(pUC19-35s::CgCP1-GFP)的構建
        2.6.5 植物表達載體(pEGAD-35s::CgCP1-GFP)的構建
        2.6.6 植物表達載體提取質粒
    2.7 橡膠樹膠孢炭疽菌原生質體的制備和轉化
    2.8 膠孢炭疽菌突變株的鑒定
    2.9 突變株的表型分析
    2.10 半定量檢測CgCP1基因表達量
    2.11 突變株機械穿透力實驗
    2.12 突變株致病性分析
    2.13 炭疽菌侵染橡膠樹葉片活性氧檢測
    2.14 黑色素含量測定
    2.15 黑色素合成酶表達量分析
    2.16 CgCP1基因中的磷酸化位點點突變
        2.16.1 擴增磷酸化位點突變的CgCP1基因
        2.16.2 CgCP1磷酸化位點突變互補載體的構建
        2.16.3 磷酸化位點突變株的鑒定
        2.16.4 磷酸化位點突變株表型分析
    2.17 植物表達載體轉化農桿菌感受態(tài)細胞
    2.18 農桿菌注射煙草瞬時表達CgCP1
    2.19 煙草細胞壞死檢測
    2.20 橡膠樹葉片原生質體制備
    2.21 橡膠樹原生質體總蛋白的提取
    2.22 western blot檢測CgCP1蛋白表達
    2.23 橡膠樹原生質體活性氧檢測
    2.24 CgCP1在橡膠樹原生質體中的亞細胞定位
3 結果與分析
    3.1 膠孢炭疽菌Cerato-platanin蛋白基因CgCP1的生物信息學分析
    3.2 CgCP1敲除突變體菌株和互補菌株的鑒定
    3.3 CgCP1基因對生長速率及產孢能力的影響
    3.4 CgCP1基因對黑色素合成的影響
    3.5 CgCP1蛋白的磷酸化對其功能的影響
    3.6 CgCP1影響膠孢炭疽菌對橡膠樹的致病力
    3.7 CgCP1對膠孢炭疽菌菌絲機械穿透力的影響
    3.8 CgCP1對植物先天免疫反應的影響
        3.8.1 CgCP1誘導橡膠樹葉片活性氧的產生
        3.8.2 CgCP1對橡膠樹防衛(wèi)反應基因HbPR1、HbPR5表達的影響
        3.8.3 CgCPl誘導煙草葉片壞死
    3.9 CgCP1在橡膠樹中的亞細胞定位
4 討論
5 結論
參考文獻
附錄
    附錄Ⅰ 引物序列表
    附錄Ⅱ 原生質體制備過程中各種試劑
    附錄Ⅲ 本實驗所用儀器及器材
    附錄Ⅳ 培養(yǎng)基及其他試劑配方
    附錄Ⅴ 凝膠片段回收
    附錄Ⅵ 轉化反應
    附錄Ⅶ 堿裂解法提取質粒
    附錄Ⅷ 沉淀回收
攻讀博士學位期間已發(fā)表學術論文
致謝



本文編號：3802863