本文關(guān)鍵詞：植物MAPK級(jí)聯(lián)途徑基因家族的進(jìn)化分析及番茄SlMPK13的功能鑒定，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPK)級(jí)聯(lián)途徑是存在于真核生物中的高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。典型的MAPK級(jí)聯(lián)途徑由三種蛋白激酶組成,即MAPK (MPK)、MAPKK (MKK、MEK)和MAPKKK (MEKK),并通過MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化作用將信號(hào)傳遞放大。MAPK級(jí)聯(lián)途徑在植物生長發(fā)育及多種逆境響應(yīng)中起重要作用。本研究從全基因組水平對(duì)兩種重要蔬菜作物,番茄和黃瓜中的MAPK級(jí)聯(lián)途徑基因家族成員進(jìn)行鑒定,并對(duì)它們的分類、保守結(jié)構(gòu)域、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)特征等進(jìn)行了分析。同時(shí)利用生物信息學(xué)方法分析了MAPK級(jí)聯(lián)途徑相關(guān)基因家族在植物中的分布及進(jìn)化關(guān)系。為進(jìn)一步探究MAPK基因在番茄生長發(fā)育過程中的功能,在分離番茄雄蕊優(yōu)勢表達(dá)基因SIMPK13的基礎(chǔ)上,我們進(jìn)行了亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)體外原核表達(dá)、體外磷酸化活性以及表達(dá)特征分析。隨后利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)研究了SlMPK13在番茄營養(yǎng)生長、花器官形態(tài)發(fā)育及花粉發(fā)育中的功能,并利用RNA-seq技術(shù)探索了其在花粉發(fā)育中的作用機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：(1)利用同源比對(duì)和HMMER搜索,在番茄基因組中共鑒定了89個(gè)MAPKKKs、5個(gè)MAPKKs和1個(gè)新的MAPK基因；在黃瓜基因組中共鑒定了59個(gè)MAPKKKs、6個(gè)MAPKKs和14個(gè)MAPKs。多序列比對(duì)、保守基序和系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明,植物MAPK和MAPKK基因家族分為A、B、C、D四個(gè)亞組,而MAPKKK基因家族則分為MEKK、RAF和ZIK三個(gè)亞組。實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)分析結(jié)果顯示,多數(shù)番茄和黃瓜MAPK級(jí)聯(lián)途徑基因在多個(gè)植物器官中普遍表達(dá),且參與多種逆境脅迫和激素的響應(yīng)過程。(2)進(jìn)化分析顯示,MAPKKK家族的基因數(shù)目在不同植物中差異很大；植物MAPKKK家族在藻類植物進(jìn)化以前就已完成三個(gè)亞族的分化；隨著進(jìn)化歷程的演變,植物MAPKKK家族主要發(fā)生了兩次基因數(shù)目的迅速擴(kuò)增,分別發(fā)生在藻類植物到苔蘚植物以及蕨類植物到開花植物的進(jìn)化過程中,且植物MAPKKK基因數(shù)目的大量擴(kuò)增主要發(fā)生在RAF亞族內(nèi)。植物MAPKK家族A、B兩個(gè)亞組的基因起源較早,在藻類植物中就已經(jīng)存在；而C、D亞組MAPKK基因成員直到開花植物才出現(xiàn)。植物MAPK基因家族的迅速擴(kuò)增發(fā)生在蕨類植物到開花植物的進(jìn)化過程中,且主要發(fā)生在D亞組內(nèi)；C、D兩個(gè)亞組MAPK基因起源于藻類植物進(jìn)化以前,A、B亞組的MAPK基因在苔蘚植物中也已出現(xiàn)。(3) QRT-PCR及原位雜交結(jié)果表明,SlMPK13在番茄植株的多個(gè)器官/組織以及雄蕊的不同發(fā)育時(shí)期中都有表達(dá),但在開放花的雄蕊中尤其是成熟花粉中優(yōu)勢表達(dá)。體外原核表達(dá)表明,SlMPK13編碼一個(gè)大小約為44 kDa的水溶蛋白。將該蛋白與磷酸化的酪氨酸抗體進(jìn)行Western雜交,結(jié)果顯示其具有體外磷酸化的活性；亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,SlMPK13定位在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。(4)構(gòu)建了花椰菜花葉病毒CaMV35S組成型啟動(dòng)子啟動(dòng)的RNA干擾載體p35S::slmpkl3-RNAi,并利用“葉盤法”遺傳轉(zhuǎn)化番茄品種'Micro-Tom'。觀察轉(zhuǎn)基因后代發(fā)現(xiàn),植株表現(xiàn)出生長矮小、葉片發(fā)育畸形、根發(fā)育受抑制、花器官異常肥大、雄蕊頂端開裂等多種表現(xiàn)型。以上結(jié)果表明,SlMPK13在番茄營養(yǎng)生長與生殖發(fā)育過程中的功能具有多效性。(5)為特異地研究SlMPK13在番茄花粉發(fā)育中的功能,我們構(gòu)建了花粉特異啟動(dòng)子LAT52啟動(dòng)的RNAi載體pLAT52::slmpkl3-RNAi。對(duì)花粉進(jìn)行表型觀察發(fā)現(xiàn),超過50%的轉(zhuǎn)基因花粉畸形,花粉生活力及萌發(fā)率下降,花粉育性顯著降低,番茄的座果率以及單果種子數(shù)目顯著下降。花粉細(xì)胞學(xué)觀察與DAPI染色結(jié)果顯示,在小孢子發(fā)育的雙核早期及其以前的幾個(gè)時(shí)期,pLAT52::slmpkl3-RNAi轉(zhuǎn)基因花粉發(fā)育正常,營養(yǎng)核及生殖核正�？梢姟ｋp核大液泡時(shí)期以后,花粉細(xì)胞膜開始呈現(xiàn)不規(guī)則凹陷及破損,液泡數(shù)目增多。隨著花粉成熟,液泡體積變大,細(xì)胞內(nèi)容物逐漸降解,最終形成皺縮干癟的花粉粒。(6)利用RNA-seq技術(shù)比較了pLAT52::slmpkl3-RNAi轉(zhuǎn)基因與對(duì)照雄蕊在不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雄蕊發(fā)育早期差異表達(dá)基因數(shù)量極少,而雄蕊發(fā)育后期有1077個(gè)差異表達(dá)基因,其中846個(gè)上調(diào)表達(dá),231個(gè)下調(diào)表達(dá)�；虮倔w論(Gene Othology, GO)和生物學(xué)代謝途徑(pathway)分析顯示,大多數(shù)差異表達(dá)基因參與“碳水化合物代謝”、“細(xì)胞元件形成”、“信號(hào)傳導(dǎo)”、“細(xì)胞凋亡”等生物學(xué)過程。結(jié)合細(xì)胞學(xué)觀察及亞細(xì)胞定位結(jié)果,我們推測,抑制SIMPK13的表達(dá)可能在花粉發(fā)育晚期啟動(dòng)了花粉細(xì)胞凋亡,使得細(xì)胞膜及液泡發(fā)育異常,細(xì)胞內(nèi)碳水化合物或脂類代謝異常,從而影響成熟花粉的形成。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S641.2
【目錄】：

• 致謝8-13
• 縮略詞13-15
• 摘要15-17
• Abstract17-20
• 前言20-23
• 1 文獻(xiàn)綜述23-36
• 1.1 MAPK級(jí)聯(lián)途徑23-26
• 1.1.1 基本組成23
• 1.1.2 植物MAPKKK23-24
• 1.1.3 植物MAPKK24-25
• 1.1.4 植物MAPK25-26
• 1.2 植物MAPK級(jí)聯(lián)途徑的生物學(xué)功能26-33
• 1.2.1 在植物生長發(fā)育中的作用26-29
• 1.2.1.1 在細(xì)胞分裂中的作用27-28
• 1.2.1.2 在細(xì)胞分化及發(fā)育中的作用28
• 1.2.1.3 在植物生殖發(fā)育中的作用28-29
• 1.2.1.4 在植物衰老和器官脫落中的作用29
• 1.2.2 在植物響應(yīng)生物脅迫中的作用29-31
• 1.2.3 在植物響應(yīng)非生物脅迫中的作用31-33
• 1.3 植物MAPK的下游作用因子33-35
• 1.4 番茄MAPK級(jí)聯(lián)途徑的研究進(jìn)展35-36
• 2 植物MAPK級(jí)聯(lián)途徑基因家族的進(jìn)化及相關(guān)基因的表達(dá)分析36-83
• 2.1 材料與方法37-40
• 2.1.1 試驗(yàn)材料37
• 2.1.2 試驗(yàn)試劑37
• 2.1.3 植物MAPK、MAPKK、MAPKKK家族成員鑒定37-38
• 2.1.4 植物MAPK級(jí)聯(lián)途徑家族基因序列特征分析38
• 2.1.5 苗期逆境脅迫處理38-39
• 2.1.6 植物MAPK級(jí)聯(lián)途徑家族基因的表達(dá)分析39-40
• 2.1.6.1 植物總RNA的提取反轉(zhuǎn)錄合成cDNA39
• 2.1.6.2 熒光實(shí)時(shí)定量PCR39-40
• 2.2 結(jié)果與分析40-81
• 2.2.1 植物MAPKKK基因家族成員的鑒定及進(jìn)化分析40-62
• 2.2.1.1 番茄MAPKKK基因的鑒定及表達(dá)特征分析40-49
• 2.2.1.2 黃瓜MAPKKK基因家族成員的鑒定及表達(dá)分析49-56
• 2.2.1.3 植物MAPKKK基因家族的進(jìn)化分析56-62
• 2.2.2 植物MAPKK基因家族成員的鑒定及進(jìn)化分析62-72
• 2.2.2.1 番茄MAPKK基因家族成員的鑒定及表達(dá)分析62-66
• 2.2.2.2 黃瓜MAPKK基因家族成員的鑒定及表達(dá)分析66-69
• 2.2.2.3 植物MAPKK基因家族的進(jìn)化分析69-72
• 2.2.3 植物MAPK基因家族成員的鑒定及進(jìn)化分析72-81
• 2.2.3.1 番茄MAPK基因家族成員的鑒定及表達(dá)分析72-74
• 2.2.3.2 黃瓜MAPK基因家族成員的鑒定及表達(dá)分析74-78
• 2.2.3.3 植物MAPK基因家族的進(jìn)化分析78-81
• 2.3 討論81-83
• 2.3.1 植物MAPKKK基因家族的進(jìn)化81
• 2.3.2 植物MAPKK基因家族的進(jìn)化81-82
• 2.3.3 植物MAPK基因家族的進(jìn)化82-83
• 3 番茄SlMPK13的表達(dá)特征及所編碼蛋白質(zhì)的基本特性分析83-99
• 3.1 材料與方法84-91
• 3.1.1 試驗(yàn)材料84
• 3.1.2 試驗(yàn)試劑84
• 3.1.3 SlMPK13的時(shí)空表達(dá)特性分析84-88
• 3.1.3.1 QRT-PCR分析84-85
• 3.1.3.2 植物組織原位雜交分析85-88
• 3.1.4 SlMPK13的基本特性分析88-91
• 3.1.4.1 原核表達(dá)分析88-90
• 3.1.4.2 蛋白SDS-PAGE電泳及Western Blot印跡90
• 3.1.4.3 SlMPK13的亞細(xì)胞定位90-91
• 3.2 結(jié)果與分析91-97
• 3.2.1 SlMPK13在番茄開放花的雄蕊中優(yōu)勢表達(dá)91-94
• 3.2.2 SlMPK13的磷酸化性質(zhì)分析94-95
• 3.2.3 SlMPK13的亞細(xì)胞定位95-97
• 3.3 討論97-99
• 3.3.1 SlMPK13是一個(gè)在成熟花藥中優(yōu)勢表達(dá)的重要基因97
• 3.3.2 SlMPK13定位于細(xì)胞各部位并具有MPK激酶活性97-99
• 4 番茄SlMPK13在花粉發(fā)育中的功能鑒定99-127
• 4.1 材料方法100-107
• 4.1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)試劑100
• 4.1.2 RNAi載體的構(gòu)建100-101
• 4.1.2.1 正義片段和反義片段序列擴(kuò)增100
• 4.1.2.2 CaMV35S組成型啟動(dòng)子的RNAi載體構(gòu)建100-101
• 4.1.2.3 番茄花粉特異啟動(dòng)子LAT52的RNAi載體構(gòu)建101
• 4.1.3 RNAi載體對(duì)番茄植株的遺傳轉(zhuǎn)化101-103
• 4.1.3.1 農(nóng)桿菌菌株的獲得與侵染菌液制備101-102
• 4.1.3.2 番茄無菌苗的培養(yǎng)102
• 4.1.3.3 番茄植株的遺傳轉(zhuǎn)化102-103
• 4.1.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測103-104
• 4.1.4.1 PCR檢測103-104
• 4.1.4.2 GUS組織化學(xué)染色104
• 4.1.4.3 QRT-PCR檢測104
• 4.1.5 轉(zhuǎn)基因番茄植株的表型觀察104-107
• 4.1.5.1 轉(zhuǎn)基因番茄植株的形態(tài)觀察104-105
• 4.1.5.2 花粉生活力觀察105-106
• 4.1.5.3 花粉形態(tài)掃描電鏡觀察106
• 4.1.5.4 花粉半薄切片觀察106
• 4.1.5.5 花粉形態(tài)超薄透射電鏡觀察106-107
• 4.2 結(jié)果與分析107-124
• 4.2.1 抑制SlMPK13表達(dá)對(duì)番茄營養(yǎng)生長的影響107-111
• 4.2.2 抑制SlMPK13表達(dá)對(duì)番茄花器官的影響111-113
• 4.2.3 SlMPK13組織特異性抑制表達(dá)對(duì)番茄花粉發(fā)育及坐果的影響113-119
• 4.2.4 抑制SlMPK13表達(dá)對(duì)花粉超微結(jié)構(gòu)的影響119-124
• 4.3 討論124-127
• 4.3.1 SlMPK13在番茄生長發(fā)育過程中的作用存在多效型124-125
• 4.3.2 SlMPK13在番茄花粉發(fā)育過程中起重要作用125-126
• 4.3.3 SlMPK13通過影響細(xì)胞膜和液泡的變化而影響番茄花粉發(fā)育126-127
• 5 抑制SlMPK13的表達(dá)對(duì)番茄轉(zhuǎn)錄組水平的影響127-139
• 5.1 材料與方法128-130
• 5.1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)試劑128
• 5.1.2 植物總RNA提取及質(zhì)量檢測128
• 5.1.3 轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建及測序128-129
• 5.1.4 測序數(shù)據(jù)處理129-130
• 5.2 結(jié)果與分析130-137
• 5.2.1 差異基因的鑒定130-132
• 5.2.2 差異表達(dá)基因的基因本體論分析132-134
• 5.2.3 差異表達(dá)基因的生物學(xué)代謝途徑分析134-137
• 5.3 討論137-139
• 5.3.1 轉(zhuǎn)錄組測序研究MAPK下游作用因子的可行性137
• 5.3.2 SlMPK13在番茄花粉成熟過程中的調(diào)控機(jī)制推測137-139
• 結(jié)論139-141
• 參考文獻(xiàn)141-157
• 附表157-186
• 博士在讀期間發(fā)表的論文186

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本文編號(hào)：377716