結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起人和動(dòng)物結(jié)核病的一種重要胞內(nèi)致病菌。它具有獨(dú)特的囊膜結(jié)構(gòu),囊膜中的脂質(zhì)組分對(duì)結(jié)核分枝桿菌識(shí)別及侵染宿主吞噬細(xì)胞、逃避宿主免疫系統(tǒng)殺傷、適應(yīng)宿主內(nèi)環(huán)境壓力等諸多方面有重要影響。磷脂酰肌醇甘露糖(PIMs)及其衍生物作為囊膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要組成成分能介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌與宿主的互作,調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答。但是,關(guān)于這些特殊脂質(zhì)組分的生物合成調(diào)控通路及其對(duì)結(jié)核分枝桿菌在宿主內(nèi)毒力的影響目前還知之甚少。本研究首先利用恥垢分枝桿菌作為模式菌株系統(tǒng)篩選和發(fā)現(xiàn)了一個(gè)分枝桿菌中保守的PIMs生物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Mpb R,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步解析了其調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌PIMs生物合成的通路,闡明了這種脂質(zhì)代謝調(diào)控對(duì)結(jié)核分枝桿菌逃避宿主免疫抑制的影響。主要結(jié)果如下:(1)文庫(kù)篩選發(fā)現(xiàn)了一個(gè)調(diào)控分枝桿菌菌落表面形態(tài)和生物被膜形成的轉(zhuǎn)錄因子Mpb R。利用TM4噬菌體侵染實(shí)驗(yàn),成功構(gòu)建了包含有約30,000個(gè)恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)轉(zhuǎn)座子插入突變體的文庫(kù)。通過(guò)觀察突變體菌株的單菌落形態(tài),分離獲得了180個(gè)...

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
縮略語(yǔ)表
1 前言
    1.1 結(jié)核分枝桿菌的囊膜結(jié)構(gòu)
    1.2 分枝桿菌囊膜中脂質(zhì)的合成及運(yùn)輸
    1.3 分枝桿菌囊膜的細(xì)菌學(xué)功能
        1.3.1 影響細(xì)菌的生長(zhǎng)及分裂
        1.3.2 影響細(xì)菌的通透性
        1.3.3 影響細(xì)菌生物被膜形成
        1.3.4 影響細(xì)菌的菌落形態(tài)
    1.4 分枝桿菌囊膜的免疫學(xué)功能
        1.4.1 影響分枝桿菌對(duì)宿主細(xì)胞的入侵
        1.4.2 影響吞噬體的成熟
        1.4.3 影響宿主的免疫應(yīng)答
    1.5 磷脂酰肌醇甘露糖(PIMs)是分枝桿菌囊膜的重要組分
        1.5.1 PIMs的生物合成
        1.5.2 PIMs的運(yùn)輸及定位
        1.5.3 PIMs影響分枝桿菌生理機(jī)能
        1.5.4 PIMs影響分枝桿菌侵染宿主細(xì)胞
        1.5.5 PIMs影響吞噬體成熟
        1.5.6 PIMs激活宿主免疫應(yīng)答
        1.5.7 PIMs抑制宿主免疫應(yīng)答
        1.5.8 PIMs作為免疫佐劑
    1.6 分枝桿菌囊膜中脂質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控
        1.6.1 脂肪酸的合成調(diào)控
        1.6.2 復(fù)雜脂質(zhì)的合成調(diào)控
    1.7 本研究的目的、意義和思路
        1.7.1 本研究的目的和意義
        1.7.2 本研究的思路
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 質(zhì)粒
        2.1.3 引物
        2.1.4 培養(yǎng)基
        2.1.5 抗生素
        2.1.6 其他試劑配方
        2.1.7 試劑與試劑盒
        2.1.8 儀器
    2.2 方法
        2.2.1 TM4噬菌體的擴(kuò)增
        2.2.2 恥垢分枝桿菌轉(zhuǎn)座子插入突變體文庫(kù)的構(gòu)建
        2.2.3 恥垢分枝桿菌菌落形態(tài)變化突變體篩選
        2.2.4 恥垢分枝桿菌突變體測(cè)序
        2.2.5 分枝桿菌重組菌株的構(gòu)建
        2.2.6 恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        2.2.7 結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
        2.2.8 恥垢分枝桿菌生物被膜的培養(yǎng)
        2.2.9 結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)恥垢分枝桿菌生物被膜
        2.2.10 結(jié)核分枝桿菌生物被膜的培養(yǎng)
        2.2.11 結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)定量檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌生物被膜
        2.2.12 結(jié)核分枝桿菌小鼠肺部存活的測(cè)定
        2.2.13 小鼠肺部病理切片實(shí)驗(yàn)
        2.2.14 結(jié)核分枝桿菌脂質(zhì)組測(cè)序
        2.2.15 結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
        2.2.16 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q RT-PCR)實(shí)驗(yàn)
        2.2.17 蛋白質(zhì)純化
        2.2.18 EMSA
        2.2.19 競(jìng)爭(zhēng)性EMSA
        2.2.20 DNase I足跡實(shí)驗(yàn)
        2.2.21 細(xì)菌單雜交實(shí)驗(yàn)(B1H)
        2.2.22 染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)
        2.2.23 β-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)
        2.2.24 制備骨髓源巨噬細(xì)胞(BMDM)
        2.2.25 BMDM細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)
        2.2.26 細(xì)胞因子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
        2.2.27 NO檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
        2.2.28 ROS檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
        2.2.29 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)
        2.2.30 免疫印跡實(shí)驗(yàn)
        2.2.31 細(xì)菌侵染率實(shí)驗(yàn)
        2.2.32 細(xì)菌胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)
3 結(jié)果與分析
    3.1 MpbR促進(jìn)分枝桿菌形成生物被膜并增強(qiáng)細(xì)菌毒力
        3.1.1 分枝桿菌突變體的篩選和鑒定
        3.1.2 MpbR調(diào)節(jié)恥垢分枝桿菌菌落形態(tài)
        3.1.3 MpbR促進(jìn)恥垢分枝桿菌生物被膜的形成
        3.1.4 MpbR促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌生物被膜的形成
        3.1.5 MpbR增強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌在小鼠內(nèi)的存活能力
    3.2 MpbR抑制結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中PIMs的積累
        3.2.1 MpbR負(fù)調(diào)控Mra1696/97 的轉(zhuǎn)錄
        3.2.2 Mra1696/97抑制結(jié)核分枝桿菌生物被膜的形成
        3.2.3 MpbR抑制結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中PIMs的積累
        3.2.4 Mra1696/97 利于結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁中PIMs的積累
    3.3 MpbR降低宿主的免疫應(yīng)答
        3.3.1 MpbR降低巨噬細(xì)胞免疫基因的轉(zhuǎn)錄
        3.3.2 MpbR抑制巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子
        3.3.3 MpbR抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO及 ROS
        3.3.4 MpbR抑制巨噬細(xì)胞凋亡
        3.3.5 MpbR促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活
4 總結(jié)與討論
    4.1 總結(jié)
    4.2 討論
        4.2.1 關(guān)于分枝桿菌脂質(zhì)合成相關(guān)基因
        4.2.2 關(guān)于結(jié)核分枝桿菌囊膜中Ac1PIM2和Ac2PIM2 的代謝調(diào)控
        4.2.3 關(guān)于Ac1PIM2和Ac2PIM2 的運(yùn)輸調(diào)控通路
        4.2.4 關(guān)于Ac1/Ac2PIM2 代謝調(diào)控對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響
        4.2.5 關(guān)于MpbR介導(dǎo)的調(diào)控對(duì)巨噬細(xì)胞ROS及 NO產(chǎn)生的影響
        4.2.6 關(guān)于MpbR介導(dǎo)的調(diào)控對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的影響
    4.3 展望
        4.3.1 關(guān)于MpbR感應(yīng)宿主胞內(nèi)環(huán)境壓力的機(jī)制
        4.3.2 關(guān)于Mra1696/97 運(yùn)輸PIMs的機(jī)制
        4.3.3 關(guān)于MpbR調(diào)節(jié)分枝桿菌囊膜中PIMs積累的新機(jī)制
        4.3.4 關(guān)于MpbR調(diào)節(jié)宿主免疫的分子機(jī)制
        4.3.5 針對(duì)MpbR或 PIMs開(kāi)發(fā)抗結(jié)核藥物的可能性
參考文獻(xiàn)
論文發(fā)表情況
致謝



本文編號(hào)：3748438