本文關(guān)鍵詞：民豬FST基因的克隆及其在冷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的功能初探，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：卵泡抑素(follistatin,FST)得名的原因是因?yàn)槠鋵?duì)促卵泡素有很強(qiáng)的抑制作用,是一種單鏈糖蛋白,最初,對(duì)卵泡抑素的研究多集中在生殖系統(tǒng)中。近年來(lái)的研究表明,FST能與TGF-β超家族的多個(gè)成員相互作用,在細(xì)胞增殖、脂肪細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞分化、調(diào)節(jié)能量代謝等生殖系統(tǒng)以外的多個(gè)生物過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本課題組在利用基因芯片篩選民豬抗寒基因時(shí),發(fā)現(xiàn)FST與民豬冷應(yīng)激存在著相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)以FST基因?yàn)檠芯繉?duì)象,對(duì)民豬FST基因及其側(cè)翼序列進(jìn)行克隆、測(cè)序,分析FST基因的核心啟動(dòng)子區(qū)及其甲基化情況,并在構(gòu)建FST基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾的豬成纖維細(xì)胞系的基礎(chǔ)上,對(duì)其在冷誘導(dǎo)引起的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用進(jìn)行了探索,通過(guò)數(shù)字基因表達(dá)譜(Digital gene expression,DGE)方法檢測(cè)其發(fā)揮作用的通路,得到的結(jié)果如下:(1)成功以基因組為模板克隆測(cè)序方法得到民豬5’側(cè)翼序列(1800 bp),與NCBI序列(GenBank No.NC_010458.3)相比相似度為99%,肝臟組織c DNA為模板克隆了民豬FST基因全長(zhǎng)CDS序列(1035 bp),與NCBI序列(GenBank No.NC_010458.3)相比有5個(gè)堿基差異,并造成3個(gè)錯(cuò)義突變,巢式PCR克隆了民豬FST基因部分3’UTR序列,PITA預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)一個(gè)hsa-miR-320c的結(jié)合位點(diǎn)。(2)采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng),在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的PK15細(xì)胞內(nèi)鑒定了豬FST基因的啟動(dòng)子活性區(qū),發(fā)現(xiàn)位于ATG上游-298bp~-291bp處的MZF1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域是影響FST基因啟動(dòng)子活性的關(guān)鍵區(qū)域,該元件缺失會(huì)顯著影響FST基因的啟動(dòng)子活性,而過(guò)表達(dá)MZF1轉(zhuǎn)錄因子可以顯著促進(jìn)FST基因的表達(dá)。(3)對(duì)不同生活緯度(溫度)的四個(gè)地方豬種耳組織樣中FST基因啟動(dòng)子核心區(qū)的甲基化情況進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在四個(gè)地方豬種中FST基因的CpG島均處于極低程度的甲基化狀態(tài),相互之間無(wú)差異。對(duì)成纖維細(xì)胞冷誘導(dǎo)過(guò)程中該區(qū)域的甲基化情況進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)冷誘導(dǎo)過(guò)程沒有改變?cè)搮^(qū)域的甲基化情況,同樣處于極低程度的甲基化狀態(tài)。(4)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了4℃處理2h、5h、16h、20h、24h和40h的豬胎兒成纖維細(xì)胞凋亡的變化并統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)現(xiàn)在最初的2h內(nèi)細(xì)胞沒有呈現(xiàn)明顯的凋亡,是凋亡過(guò)程的誘導(dǎo)期,2h-5h細(xì)胞出現(xiàn)了顯著的凋亡,并且凋亡程度與冷誘導(dǎo)時(shí)間成正比,40h時(shí),細(xì)胞幾乎全部裂解死亡。(5)Real-time PCR和Western blot檢測(cè)4℃冷誘導(dǎo)過(guò)程中FST基因的表達(dá),發(fā)現(xiàn)此過(guò)程中FST基因的表達(dá)量不斷上調(diào),推測(cè)FST基因在抵抗細(xì)胞冷誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Real-time PCR檢測(cè)了細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的Bcl-2、Bcl-2l1和Bax基因的變化,發(fā)現(xiàn)各基因表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì),Bcl-2基因在4℃處理24h后出現(xiàn)極顯著下調(diào)。(6)原代培養(yǎng)豬胎兒成纖維細(xì)胞,構(gòu)建FST基因的pc DNA3.1(+)-FST真核表達(dá)載體和pSilencer-FR1的RNA干擾載體,轉(zhuǎn)染并G418篩選,成功建立了FST基因穩(wěn)定干擾和穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的豬胎兒成纖維細(xì)胞系。(7)MTT法檢測(cè)FST基因?qū)?xì)胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)FST基因過(guò)表達(dá)能顯著促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖,FST基因干擾后,與正常細(xì)胞相比增殖緩慢,但與陰性對(duì)照組相比,差異不顯著。(8)4℃冷誘導(dǎo)5h,FST基因過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡程度較弱,而FST基因干擾組細(xì)胞出現(xiàn)局部變大、空泡等凋亡現(xiàn)象。Real-time PCR檢測(cè)了FST基因?qū)?℃冷誘導(dǎo)過(guò)程中Bcl-2、Bcl-2l1和Bax基因表達(dá)的影響,發(fā)現(xiàn)與對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)空白組和陰性對(duì)照組細(xì)胞相比,FST基因過(guò)表達(dá)能促進(jìn)Bcl-2和Bcl-2l1基因表達(dá)上調(diào)和Bax基因表達(dá)下調(diào),并且與FST基因干擾組細(xì)胞相比,FST基因過(guò)表達(dá)能明顯上調(diào)Bcl-2/Bax基因表達(dá)的比例。(9)數(shù)字基因表達(dá)譜方法檢測(cè)并分析FST基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾的細(xì)胞系中的差異表達(dá)基因,并對(duì)其進(jìn)行了GO分析和pathway顯著性富集。發(fā)現(xiàn)兩實(shí)驗(yàn)組中與凋亡相關(guān)的通路都指向了p53信號(hào)通路。推測(cè)FST基因參與p53信號(hào)通路的調(diào)節(jié),在細(xì)胞冷誘導(dǎo)產(chǎn)生的凋亡中發(fā)揮作用。
【關(guān)鍵詞】：卵泡抑素(follistatin FST) 啟動(dòng)子 甲基化 冷誘導(dǎo) 功能 通路
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S828
【目錄】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 1 前言14-30
• 1.1 Follistatin及其基因的結(jié)構(gòu)特征14
• 1.2 FST的生物學(xué)作用及其機(jī)制14-17
• 1.2.1 卵泡抑素-激活素調(diào)控系統(tǒng)14-15
• 1.2.2 卵泡抑素在動(dòng)物生殖系統(tǒng)中的作用15
• 1.2.3 卵泡抑素在生殖系統(tǒng)以外的生物學(xué)作用15-17
• 1.2.4 FST的分泌調(diào)節(jié)17
• 1.3 DNA甲基化17-23
• 1.3.1 DNA甲基化的形式和機(jī)制存在差異17-18
• 1.3.2 DNA全新甲基化的引發(fā)18-19
• 1.3.3 DNA甲基化調(diào)控基因表達(dá)的兩種假說(shuō)19
• 1.3.4 DNA甲基化的功能19-21
• 1.3.5 影響DNA甲基化的因素21-22
• 1.3.6 DNA甲基化主要的研究方法22-23
• 1.4 冷誘導(dǎo)與細(xì)胞凋亡23-25
• 1.4.1 冷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制23-25
• 1.4.2 細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因25
• 1.5 RNA干擾技術(shù)25-26
• 1.5.1 RNA干擾技術(shù)的特點(diǎn)25-26
• 1.5.2 RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用26
• 1.6 測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用26-28
• 1.6.1 第一代測(cè)序技術(shù)26
• 1.6.2 第二代測(cè)序技術(shù)26-27
• 1.6.3 第三代測(cè)序技術(shù)27
• 1.6.4 基因差異表達(dá)技術(shù)27
• 1.6.5 數(shù)字基因表達(dá)譜27-28
• 1.7 本研究的目的和意義28-30
• 2 實(shí)驗(yàn)材料與方法30-52
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料30-33
• 2.1.1 動(dòng)物組織30
• 2.1.2 細(xì)胞株30
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材30
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器30-31
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)主要藥品配制31-32
• 2.1.6 主要分子生物學(xué)軟件32
• 2.1.7 相關(guān)生物信息學(xué)網(wǎng)站32-33
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法33-52
• 2.2.1 豬基因組DNA的提取33
• 2.2.2 民豬總RNA提取33-34
• 2.2.3 民豬FST基因啟動(dòng)子區(qū)、CDS區(qū)和 3’UTR克隆測(cè)序34-36
• 2.2.4 FST基因CDS區(qū)克隆測(cè)序36
• 2.2.5 FST基因 3’UTR區(qū)克隆測(cè)序36
• 2.2.6 豬FST基因核心啟動(dòng)子定位36-42
• 2.2.7 四種地方豬FST基因啟動(dòng)子核心區(qū)的甲基化狀態(tài)的檢測(cè)42-44
• 2.2.8 FST基因在豬胎兒成纖維細(xì)胞冷誘導(dǎo)過(guò)程中的作用初探44-46
• 2.2.9 FST基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾成纖維細(xì)胞系的建立46-50
• 2.2.10 FST基因過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞的影響50
• 2.2.11 過(guò)表達(dá)和干擾細(xì)胞系的數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序50-52
• 3 結(jié)果與分析52-91
• 3.1 民豬FST基因啟動(dòng)子區(qū)、CDS區(qū)和 3’UTR的克隆測(cè)序結(jié)果52-62
• 3.1.1 豬基因組DNA提取52
• 3.1.2 民豬總RNA提取52-53
• 3.1.3 民豬FST基因啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增結(jié)果53-55
• 3.1.4 民豬FST基因CDS區(qū)擴(kuò)增結(jié)果55-56
• 3.1.5 民豬FST基因 3’UTR的擴(kuò)增結(jié)果56-58
• 3.1.6 民豬FST基因核心啟動(dòng)子的定位58-62
• 3.2 四種地方豬FST基因啟動(dòng)子核心區(qū)的甲基化狀態(tài)比較62-63
• 3.3 冷誘導(dǎo)對(duì)豬成纖維細(xì)胞的影響及FST基因的功能63-71
• 3.3.1 4℃冷誘導(dǎo)對(duì)豬成纖維細(xì)胞凋亡的影響63-69
• 3.3.2 4 ℃冷誘導(dǎo)FST基因甲基化變化情況69-70
• 3.3.3 冷誘導(dǎo)過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)變化70-71
• 3.4 FST基因穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾成纖維細(xì)胞系的建立71-74
• 3.4.1 重組真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-FST的構(gòu)建71
• 3.4.2 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FST基因的成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和篩選71-72
• 3.4.3 重組干擾質(zhì)粒的構(gòu)建72-73
• 3.4.5 穩(wěn)定干擾FST基因的成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和篩選73-74
• 3.5 FST基因過(guò)表達(dá)和干擾對(duì)細(xì)胞的影響74-78
• 3.5.1 FST基因?qū)ωi成纖維細(xì)胞增殖的影響74
• 3.5.2 穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和干擾FST基因?qū)Τ衫w維細(xì)胞冷誘導(dǎo)的影響74-76
• 3.5.3 細(xì)胞形態(tài)觀察76
• 3.5.4 各實(shí)驗(yàn)組凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量76-78
• 3.5.5 FST基因?qū)cl-2 和Bax比例關(guān)系的影響78
• 3.6 數(shù)字基因表達(dá)譜結(jié)果分析78-91
• 3.6.1 RNA的質(zhì)量檢測(cè)78-79
• 3.6.2 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估79-81
• 3.6.3 基因表達(dá)定量81-91
• 4 討論91-95
• 4.1 民豬FST基因的基本信息91
• 4.2 民豬FST基因核心啟動(dòng)子的定位91
• 4.3 FST基因與細(xì)胞增殖91-92
• 4.4 冷誘導(dǎo)與DNA甲基化92
• 4.5 冷誘導(dǎo)與豬成纖維細(xì)胞凋亡92-93
• 4.6 冷誘導(dǎo)與相關(guān)基因表達(dá)的變化93
• 4.7 FST基因與成纖維細(xì)胞冷誘導(dǎo)93-94
• 4.8 FST基因發(fā)揮作用的通路94-95
• 5 結(jié)論95-96
• 致謝96-97
• 參考文獻(xiàn)97-107
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文107

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8 楊俊靜;豬GPAT基因克隆、變異和表達(dá)規(guī)律分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

9 楊秀芹;五品種（品系）豬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的RAPD及其myostatin基因啟動(dòng)區(qū)的RFLP分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2002年

  本文關(guān)鍵詞：民豬FST基因的克隆及其在冷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的功能初探，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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