動物克隆技術在加快豬的種質(zhì)遺傳改良、建立人類疾病動物模型和異種器官移植等方面具有巨大優(yōu)勢,這使豬成為生物醫(yī)學領域的熱點模式動物,但是豬克隆的效率非常低下,相關實驗材料成熟卵子無法大量獲取,而且克隆技術體系掌握不易且仍有待繼續(xù)完善改進,這極大地限制了豬克隆技術的生產(chǎn)應用。目前,在小鼠上已有報道證實克隆胚胎發(fā)育過程中的合子基因組激活(Zygotic Genome Activation,ZGA)異常是導致克隆效率低下的主要原因之一,然而,有關豬克隆胚胎ZGA的情況還不清楚,因此繼續(xù)深入探究豬克隆胚胎在ZGA時期轉錄及表觀遺傳模式的異常,并以此為切入點尋找提高豬克隆效率的有效方法具有十分重要的意義。本研究通過比較豬正常體內(nèi)受精胚胎和克隆胚胎在轉錄水平以及表觀修飾上的差異,發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾H3K9me3和H3K27me3大量富集導致了異常的ZGA,本研究提供了一種通過H3K27me3編寫酶的抑制劑GSK126和過表達KDM4A提高豬克隆胚胎的體細胞重編程及體外發(fā)育潛能的有效策略,有助于進一步推進豬克隆胚胎的臨床應用。此外,豬克隆胚胎構建所需的成熟卵子長時間暴露于體外環(huán)境下會遭受嚴重的氧化應激傷害,...

【文章頁數(shù)】：142 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表(Abbreviation)
1 前言
    1.1 研究問題由來
    1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀
        1.2.1 動物克隆技術
        1.2.2 合子基因組激活(ZGA)
        1.2.3 克隆胚胎的表觀修飾重編程異常
        1.2.4 提高克隆效率的策略
    1.3 研究的目的和意義
2 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料與儀器設備
    2.2 豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)基制備
    2.3 豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)
        2.3.1 豬卵巢采集
        2.3.2 卵丘-卵母細胞復合體（Cumulus-Oocyte-Complex，COC）挑揀及培養(yǎng)
        2.3.3 配制Tyrode’s lactate-HEPES-PVA medium(TLH-PVA)
    2.4 豬體細胞核移植顯微操作針制備
        2.4.1 拉針
        2.4.2 斷針
        2.4.3 磨針
        2.4.4 洗針
        2.4.5 拉尖
        2.4.6 打彎
    2.5 豬胎兒成纖維細胞(Porcine Fetus Fibroblast,PFF)培養(yǎng)
        2.5.1 細胞培養(yǎng)基配制
        2.5.2 PFF培養(yǎng)及SCNT前的處理
    2.6 豬體細胞核移植
        2.6.1 相關培養(yǎng)液配制
        2.6.2 挑揀成熟卵
        2.6.3 顯微操作盤制備
        2.6.4 去核——盲吸法
        2.6.5 注核
        2.6.6 電融合
    2.7 孤雌激活
    2.8 克隆胚胎mRNA注射
        2.8.1 基因克隆
        2.8.2 體外轉錄
        2.8.3 克隆胚胎mRNA注射
    2.9 卵子早期凋亡檢測
    2.10 ROS水平檢測
    2.11 線粒體膜電位水平檢測
    2.12 谷胱甘肽(GSH)檢測
    2.13 TUNEL法檢測凋亡細胞
    2.14 免疫熒光染色
    2.15 微量樣品總RNA提取
    2.16 cDNA第一鏈合成
    2.17 實時定量PCR
    2.18 低細胞量RNA-seq
    2.19 PFF普通轉錄組測序
    2.20 ULI-Ch IP-seq
        2.20.1 所需溶液配方
        2.20.2 N-ChIP
        2.20.3 KAPA建庫
    2.21 統(tǒng)計學分析
3 實驗結果
    3.1 測序樣品質(zhì)量檢測
    3.2 豬克隆胚胎pre-ZGA時期存在異常的基因轉錄
    3.3 豬4細胞期克隆胚胎重編程抵抗區(qū)和記憶保留區(qū)的發(fā)掘
    3.4 阻遏性組蛋白修飾H3K9me3和H3K27me3 是豬克隆胚胎pre-ZGA起始期的重編程障礙
    3.5 豬4 細胞期克隆胚胎記憶保留區(qū)異常富集組蛋白修飾H3K9me3和H3K27me3
    3.6 通過過表達KDM4A來促進豬的體細胞重編程
    3.7 過表達KDM4A聯(lián)合GSK126 處理進一步促進了豬克隆胚胎的發(fā)育潛能
    3.8 褪黑素緩解卵子老化并促進胚胎發(fā)育
        3.8.1 確定褪黑素處理體外老化卵子的最佳濃度
        3.8.2 褪黑素提高體外老化卵子孤雌胚胎的發(fā)育能力
        3.8.3 褪黑素緩解體外老化卵子的氧化應激水平
        3.8.4 褪黑素降低體外老化卵子的早期凋亡水平
        3.8.5 褪黑素延緩體外老化卵子線粒體膜電位降低
        3.8.6 褪黑素降低體外老化卵子的自噬水平
4 討論
    4.1 克隆胚胎重編程不完全
    4.2 異常組蛋白修飾H3K9me3和H3K27me3 是體細胞重編程的主要障礙
    4.3 去除異常組蛋白修飾H3K9me3和H3K27me3 有利于克隆胚胎的體細胞重編程
    4.4 技術革新和組合策略提高克隆重編程
    4.5 褪黑素維持體外老化卵子質(zhì)量并提高其胚胎發(fā)育潛能
5 小結
    5.1 本研究的主要結果與結論
    5.2 本研究的創(chuàng)新之處
    5.3 本研究的不足之處及建議
參考文獻
附錄
博士期間發(fā)表的論文
致謝



本文編號：3736853