再生作為Science公布的125個(gè)最具科學(xué)挑戰(zhàn)的科學(xué)問題中的第7個(gè)問題,一直是最受關(guān)注的科學(xué)熱點(diǎn)。目前再生研究主要集中在果蠅、渦蟲、蠑螈等模式動(dòng)物與人類器官再生研究。刺參作為棘皮動(dòng)物,為無脊索動(dòng)物中分類地位最高等的類群,具有超強(qiáng)的再生能力,在應(yīng)答刺激會(huì)排出內(nèi)臟,并很快再生出一套完整的內(nèi)臟器官,正逐漸成為研究再生的新模型。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的修飾之一,能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象與穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變,從而控制基因表達(dá),其控制細(xì)胞重編程與干細(xì)胞分化,對(duì)器官再生起到重要的調(diào)控作用。由于研究手段與基礎(chǔ)數(shù)據(jù)缺乏等原因,無脊椎動(dòng)物中特別是棘皮動(dòng)物中的DNA甲基化對(duì)動(dòng)物特殊生理行為的調(diào)控研究嚴(yán)重滯后,本人所在團(tuán)隊(duì)的刺參基因組的解析為DNA甲基化修飾對(duì)刺參腸道再生的調(diào)控研究帶來了良好的契機(jī)。綜上所述,研究DNA甲基化修飾和候選再生基因在刺參腸道再生中的作用不僅為海參腸道再生的分子機(jī)制研究提供參考,而且可以為人類再生醫(yī)學(xué)研究提供新思路,同時(shí)可以為DNA甲基化再生藥物研制和再生途徑研究提供理論指導(dǎo)。本研究利用 WGBS（Whole Genome Bisulfite Sequen... 

【文章頁數(shù)】：182 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 DNA甲基化研究進(jìn)展
        1.1.1 DNA甲基化
        1.1.2 DNA甲基化調(diào)控轉(zhuǎn)錄機(jī)制
    1.2 DNA甲基化調(diào)控酶研究進(jìn)展
        1.2.1 DNA甲基化酶
        1.2.2 DNA去甲基化酶
    1.3 再生相關(guān)信號(hào)通路和基因研究概述
        1.3.1 Src/PI3K/Akt信號(hào)通路
        1.3.2 MAPK/ERK信號(hào)通路
        1.3.3 JAK/STAT信號(hào)通路
        1.3.4 Wnt信號(hào)通路
        1.3.5 再生相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子
        1.3.6 其他再生相關(guān)基因
    1.4 棘皮動(dòng)物再生研究進(jìn)展
    1.5 海參再生研究進(jìn)展
    1.6 本研究的目的意義與研究思路
        1.6.1 目的與意義
        1.6.2 科學(xué)問題
        1.6.3 研究內(nèi)容與技術(shù)路線
        1.6.4 預(yù)期成果
    1.7 本章小結(jié)
第二章 DNA甲基化調(diào)控酶在刺參腸道再生中的調(diào)控機(jī)制研究
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 樣品采集
        2.2.2 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄
        2.2.3 刺參DNA甲基化調(diào)控酶Dnmt3b、TDG和Tet2過表達(dá)載體構(gòu)建
        2.2.4 RNAi片段siRNA制備
        2.2.5 刺參Dnmt3b、TDG和Tet2基因體內(nèi)過表達(dá)和RNAi
        2.2.6 刺參Dnmt3b、TDG和Tet2基因體外過表達(dá)
        2.2.7 CCK8細(xì)胞增殖檢測
        2.2.8 刺參Dnmt3b、TDG和Tet2基因序列和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
        2.2.9 數(shù)據(jù)分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 DNA甲基化調(diào)控酶和甲基結(jié)合蛋白在刺參腸道再生過程中的表達(dá)特征
        2.3.2 刺參Dnmt3b、TDG和Tet2基因過表達(dá)載體構(gòu)建
        2.3.3 刺參Dnmt3b、TDG和Tet2基因序列和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析
        2.3.4 刺參Dnmt3b、TDG和Tet2基因體外過表達(dá)
        2.3.5 體外過表達(dá)Dnmt3b、TDG和Tet2對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響
        2.3.6 體外過表達(dá)刺參Dnmt3b、TDG和Tet2基因?qū)CT116細(xì)胞增殖的影響
        2.3.7 體內(nèi)過表達(dá)Dnmt3b、Tet2和TDG對(duì)刺參細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響
        2.3.8 體內(nèi)干擾刺參Dnmt3b、Tet2和TDG基因?qū)Υ虆⒃鲋诚嚓P(guān)基因表達(dá)的影響
    2.4 討論
        2.4.1 DNA甲基化和DNA去甲基化同時(shí)參與刺參腸道再生初期的基因調(diào)控
        2.4.2 刺參DNA甲基化調(diào)控酶基因Dnmt3b、Tet2和TDG序列和進(jìn)化樹分析
        2.4.3 刺參DNA甲基化調(diào)控酶基因Dnmt3b、Tet2和TDG參與調(diào)控增殖相關(guān)基因的表達(dá)
    2.5 本章小結(jié)
第三章 DNA甲基化對(duì)刺參腸道再生的影響
    3.1 前言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 樣品采集
        3.2.2 刺參腸道原代細(xì)胞培養(yǎng)
        3.2.3 刺參腸道原代細(xì)胞存活率檢測
        3.2.4 CCK8檢測刺參腸道原代細(xì)胞增殖
        3.2.5 藥物處理后基因檢測實(shí)驗(yàn)
        3.2.6 刺參腸道原代細(xì)胞總RNA提取和RT-qPCR
        3.2.7 5-氮雜胞苷體內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 刺參腸道原代細(xì)胞培養(yǎng)
        3.3.2 抑制DNA甲基化對(duì)吐腸后刺參體內(nèi)腸道再生的影響
        3.3.3 抑制DNA甲基化對(duì)吐腸后刺參體內(nèi)腸道組織基因表達(dá)的影響
    3.4 討論
        3.4.1 DNA甲基化在刺參腸道再生中的關(guān)鍵作用
        3.4.2 抑制DNA甲基化對(duì)刺參腸道增殖和DNA甲基化相關(guān)基因表達(dá)的影響
    3.5 本章小結(jié)
第四章 刺參腸道再生DNA甲基化圖譜構(gòu)建
    4.1 前言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 樣品采集
        4.2.2 DNA提取
        4.2.3 全基因組DNA甲基化建庫測序流程
        4.2.4 序列比對(duì)與DNA甲基化水平檢測
        4.2.5 差異DNA甲基化區(qū)域與DNA甲基化水平差異檢測
        4.2.6 GO注釋與KEGG富集分析
        4.2.7 DNA甲基化基因DNA序列獲取
        4.2.8 PCR產(chǎn)物純化測序
        4.2.9 DNA克隆
        4.2.10 硫化處理
        4.2.11 BSP-PCR擴(kuò)增
        4.2.12 BSP-PCR產(chǎn)物純化和目的片段克隆測序
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 DNA質(zhì)量
        4.3.2 全基因組DNA甲基化數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
        4.3.3 全基因組和不同轉(zhuǎn)錄元件DNA甲基化水平分析
        4.3.4 DMRs相關(guān)基因數(shù)量統(tǒng)計(jì)
        4.3.5 DMRs相關(guān)基因的GO和KEGG分析
        4.3.6 DMRs相關(guān)基因BSP驗(yàn)證
    4.4 討論
        4.4.1 刺參腸道再生不同時(shí)間的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制不同
        4.4.2 神經(jīng)、免疫和代謝相關(guān)通路參與刺參腸道再生受DNA甲基化調(diào)控
        4.4.3 蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子和粘附分子類基因參與腸道再生受DNA甲基化調(diào)控
    4.5 本章小結(jié)
第五章 刺參腸道再生初級(jí)階段轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜的構(gòu)建
    5.1 前言
    5.2 材料與方法
        5.2.1 樣品采集
        5.2.2 總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建與測序、序列過濾、比對(duì)和質(zhì)量評(píng)估
        5.2.3 基因表達(dá)定量分析及差異表達(dá)基因(DEG)篩選
        5.2.4 GO功能和KEGG富集分析
        5.2.5 DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析
        5.2.6 Real time PCR
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
        5.3.2 RT-qPCR驗(yàn)證
        5.3.3 DEGs篩選和熱圖聚類分析
        5.3.4 DEGs的GO和KEGG富集分析
    5.4 討論
    5.5 本章小結(jié)
第六章 再生候選基因在刺參腸道再生中的調(diào)控機(jī)制
    6.1 前言
    6.2 材料與方法
        6.2.1 樣品采集和處理
        6.2.2 mRNA和蛋白提取
        6.2.3 RACE克隆
        6.2.4 RT-qPCR
        6.2.5 抗體制備和Western blot
        6.2.6 免疫組織化學(xué)和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測
        6.2.7 過表達(dá)載體構(gòu)建
        6.2.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染
        6.2.9 細(xì)胞增殖檢測
        6.2.10 序列聚類分析和數(shù)據(jù)分析
    6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.3.1 DNA甲基化候選基因在刺參腸道再生過程中的表達(dá)特征
        6.3.2 過表達(dá)載體構(gòu)建
        6.3.3 開放閱讀框序列克隆和分析
        6.3.4 體外過表達(dá)DNA甲基化候選基因?qū)υ鲋诚嚓P(guān)基因的影響
        6.3.5 WntA基因序列和表達(dá)特征分析
        6.3.6 WntA蛋白表達(dá)定位
        6.3.7 刺參腸道再生過程中的增殖與凋亡
        6.3.8 Wnt家族基因以及信號(hào)通路關(guān)鍵基因在刺參腸道再生中的表達(dá)特征
    6.4 討論
        6.4.1 DNA甲基化候選基因調(diào)控刺參腸道再生機(jī)制
        6.4.2 候選基因WntA在刺參腸道再生中的作用
        6.4.3 Wnt信號(hào)通路參與刺參腸道再生
    6.5 本章小結(jié)
第七章 總結(jié)與展望
    7.1 總結(jié)
    7.2 創(chuàng)新性
    7.3 存在問題
    7.4 研究展望
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡歷及攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果



本文編號(hào)：3675044