本文關(guān)鍵詞：牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化相關(guān)miRNAs鑒定及功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：肌肉發(fā)育分化是發(fā)育生物學(xué)研究的重要內(nèi)容,已有的研究表明miRNAs在肌肉發(fā)育和肌細(xì)胞增殖與分化中發(fā)揮了關(guān)鍵性的調(diào)控作用,而有關(guān)牛肌肉miRNAs及其參與肌肉生長發(fā)育和分化調(diào)控的研究還比較少。本研究擬分離培養(yǎng)牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,進(jìn)行純化和鑒定,建立體外成肌誘導(dǎo)分化模型,然后通過miRNA芯片篩選出肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前后差異表達(dá)的mi RNAs,real-time PCR驗(yàn)證芯片篩選結(jié)果,選出成肌分化相關(guān)miRNAs,利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miRNAs的靶基因,并對靶基因進(jìn)行進(jìn)一步的功能分析,構(gòu)建成肌分化相關(guān)miRNAs及其靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。選擇有代表性的成肌分化相關(guān)miRNAs,參考相關(guān)文獻(xiàn)確認(rèn)其靶基因,通過表達(dá)調(diào)控實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)對靶基因進(jìn)行驗(yàn)證,并選用miRNA mimics、miRNA inhibitors或構(gòu)建真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛肌衛(wèi)星細(xì)胞上調(diào)或下調(diào)miRNAs的表達(dá)豐度,通過細(xì)胞增殖及分化檢測,研究分化相關(guān)miRNAs對肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控作用。通過這些研究,系統(tǒng)地闡明肌衛(wèi)星細(xì)胞與mi RNAs表達(dá)的相互作用機(jī)制,為肌細(xì)胞發(fā)育分化的miRNAs調(diào)控機(jī)制積累基礎(chǔ)資料,并為肉牛新品種培育提供新的思路和有益的線索。1.本研究對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化和鑒定,采用膠原酶和胰酶聯(lián)用的酶消化法分離肌衛(wèi)星細(xì)胞,應(yīng)用差速貼壁法進(jìn)行純化,觀察衛(wèi)星細(xì)胞及誘導(dǎo)分化后肌管的形態(tài)結(jié)構(gòu),并利用標(biāo)志基因的反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和免疫熒光染色方法對分化前后細(xì)胞進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示分離出的肌衛(wèi)星細(xì)胞呈梭形生長,生長狀態(tài)良好,RT-PCR和免疫熒光染色顯示肌衛(wèi)星細(xì)胞Pax7和MyoD呈陽性表達(dá),純化后的肌衛(wèi)星細(xì)胞純度大于93%;誘導(dǎo)分化后,衛(wèi)星細(xì)胞融合生長,形成的肌管狀態(tài)良好,分化標(biāo)志基因MyoG和MHC呈陽性表達(dá)。本研究建立了一套從牛肌肉組織中分離和鑒定肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法,可以為肌肉的發(fā)育分化和肉牛肉質(zhì)改良研究提供良好的細(xì)胞模型。2.本研究對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行體外分離培養(yǎng),研究堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長的影響,通過在生長和分化培養(yǎng)基中添加bFGF,觀察細(xì)胞生長及分化情況,繪制細(xì)胞生長曲線并進(jìn)行EdU細(xì)胞增殖檢測實(shí)驗(yàn),探討bFGF對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響。研究結(jié)果表明無論在生長培養(yǎng)基或分化培養(yǎng)基中,添加bFGF都可以顯著提高細(xì)胞增殖率,說明bFGF有明顯的促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的作用。本研究建立了一種高效的牛肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)方案,可以為骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的研究利用提供參考。3.為了研究在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過程中miRNAs的表達(dá)模式和作用機(jī)制,本研究采用miRNAs芯片技術(shù)對牛肌衛(wèi)星成肌分化過程中783個(gè)牛成熟miRNAs的表達(dá)模式進(jìn)行檢測,芯片篩選出了17個(gè)可信度較高的差異表達(dá)mirnas,進(jìn)一步通過定量pcr技術(shù)對芯片分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,最終得到15個(gè)在肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過程中顯著差異表達(dá)的mirnas,其中12個(gè)上調(diào)表達(dá),3個(gè)下調(diào)表達(dá),上調(diào)的mirnas包括mir-1、mir-206、mir-128、mir-133a、mir-133b、mir-143、mir-145、mir-193b、mir-139、mir-378、mir-378b、mir-378c,下調(diào)的mirnas是mir-222、mir-335和mir-376e。4.進(jìn)一步利用生物信息學(xué)分析方法對篩選出的成肌分化相關(guān)mirnas進(jìn)行靶基因預(yù)測,總共預(yù)測出了3077個(gè)靶基因,其中有些靶基因已經(jīng)被報(bào)道過在肌肉發(fā)育和分化中發(fā)揮了相應(yīng)的作用,對靶基因進(jìn)行了進(jìn)一步的go和kegg分析,分析結(jié)果顯示這些靶基因主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、多細(xì)胞生物發(fā)育和細(xì)胞分化等有關(guān)的生物學(xué)過程中。kegg分析結(jié)果表明這些預(yù)測出的靶基因主要富集在mapk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、神經(jīng)突觸傳導(dǎo)、t細(xì)胞受體信號通路以及造血細(xì)胞通路等上面。研究結(jié)果表明,這些成肌分化相關(guān)mirnas可能在牛成肌分化過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。5.由于mir-1和mir-206具有相同的種子序列(5’端的2 8nt),推測它們可能調(diào)控相同或者相似的靶基因,因此在本部分研究中選擇高表達(dá)且已有相關(guān)研究報(bào)道的mir-1和mir-206進(jìn)行后續(xù)的功能驗(yàn)證工作,對其在牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化中的作用進(jìn)行了研究。從mir-1和mir-206的靶基因中選擇hdac4和pax7進(jìn)行雙熒光素酶調(diào)控實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)mir-1和mir-206可以與hdac4和pax7的3’utr結(jié)合而發(fā)揮調(diào)控作用,同時(shí)進(jìn)行了在肌衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控實(shí)驗(yàn),包括過表達(dá)和抑制表達(dá)實(shí)驗(yàn),rt-pcr和westernblot檢測發(fā)現(xiàn)在未分化的狀態(tài)下,mir-1和mir-206表達(dá)水平的變化可以影響hdac4和pax7的蛋白表達(dá)水平。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)mir-1和mir-206可以調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化過程。過表達(dá)mir-1和mir-206抑制了肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)了其成肌分化過程,而抑制表達(dá)則促進(jìn)了衛(wèi)星細(xì)胞的增殖并抑制其分化過程。本部分研究結(jié)果表明mir-1和mir-206可以通過調(diào)控pax7和hdac4的表達(dá)來促進(jìn)牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化過程。6.mir-1和mir-206在牛肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化中的功能驗(yàn)證進(jìn)一步說明了前期芯片篩選結(jié)果的可靠性,接下來我們參考相關(guān)文獻(xiàn)對篩選出的成肌分化相關(guān)mirnas進(jìn)行了綜合分析,對部分已有相關(guān)功能研究報(bào)道的mirnas,本研究不再進(jìn)行深入的功能驗(yàn)證分析。接下來,我們對尚未見報(bào)道的mirnas進(jìn)行了初步的研究分析,綜合芯片分析結(jié)果,參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,并通過初步的靶基因篩選和驗(yàn)證工作,本研究進(jìn)一步選擇mir-139進(jìn)行更深入的功能驗(yàn)證工作。因mir-139的靶基因主要作用于tgfβ、wnt、rho及mapk/pi3k等信號通路,綜合分析后選擇n-ras、tgfβ3和igf1r作為mir-139的靶基因進(jìn)行后續(xù)的分析工作。研究結(jié)果表明,mir-139通過直接作用于igf1r和n-ras的3’-utr下調(diào)靶基因的表達(dá)水平。過表達(dá)mir-139抑制了成肌細(xì)胞增殖和分化,而抑制mir-139則促進(jìn)了肌衛(wèi)星細(xì)胞分化,同時(shí)對細(xì)胞增殖也具有一定的抑制作用。在mir-139對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化調(diào)控中,成肌細(xì)胞增殖主要是由mapk依賴的途徑調(diào)控,而成肌細(xì)胞分化則主要是由PI3K/Akt依賴的途徑調(diào)控的。過表達(dá)miR-139后,IGF1R和N-ras的蛋白表達(dá)水平下調(diào),相應(yīng)的p-Akt和p-ERK1/2水平也發(fā)生下調(diào),p-ERK1/2水平下調(diào)抑制了細(xì)胞增殖,而p-Akt水平的下降抑制了成肌細(xì)胞的分化,這可能是miR-139過表達(dá)既抑制增殖又抑制分化的原因。抑制miR-139表達(dá)后,可以解除對IGF1R和N-ras抑制作用,p-Akt和p-ERK1/2水平上升,p-Akt水平的上升又引起了MyoD表達(dá)水平的升高,對肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化起到了促進(jìn)作用,而p-ERK1/2水平上升并未促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞的增殖,可能是其作用被MyoD的促分化和抑制細(xì)胞周期的作用所掩蓋。研究結(jié)果表明miR-139可以通過調(diào)控N-ras和IGF1R的表達(dá),進(jìn)而通過調(diào)控MAPK和PI3K/Akt信號通路來調(diào)控牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化過程。本研究揭示了mi R-139在肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化中的調(diào)控作用,失神經(jīng)肌萎縮模型中的實(shí)驗(yàn)也表明mi R-139在體內(nèi)也發(fā)揮了重要的調(diào)控作用,研究結(jié)果可以為骨骼肌的發(fā)育、肌損傷修復(fù)研究和牛肉質(zhì)改良研究提供一定的參考。
【關(guān)鍵詞】：牛 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞 miRNAs 成肌分化
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S823
【目錄】：

• 摘要6-9
• ABSTRACT9-15
• 文獻(xiàn)綜述15-34
• 第一章 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞及肌肉發(fā)育分化的研究進(jìn)展15-24
• 1.1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的生物學(xué)特性15-19
• 1.1.1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)15
• 1.1.2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的生物學(xué)特性15-18
• 1.1.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)方法及研究進(jìn)展18-19
• 1.2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在肌肉發(fā)育、分化及損傷修復(fù)中的作用19-21
• 1.2.1 骨骼肌的發(fā)生發(fā)育過程及影響因素19-20
• 1.2.2 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在肌肉發(fā)育分化中的作用20
• 1.2.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞在肌損傷修復(fù)中的作用20-21
• 1.3 成肌調(diào)節(jié)因子MRFs對肌肉發(fā)育分化的影響21-22
• 1.3.1 MRFs的發(fā)現(xiàn)21
• 1.3.2 MRFs的結(jié)構(gòu)與功能21
• 1.3.3 MRFs在肌肉發(fā)育分化中的作用21-22
• 1.4 小結(jié)與展望22-24
• 第二章 miRNAs的生物學(xué)特性及其對肌肉發(fā)育的影響24-34
• 2.1 miRNAs的發(fā)現(xiàn)24-25
• 2.2 miRNAs的生物合成、分布與表達(dá)特征25-27
• 2.3 miRNAs的作用機(jī)制及研究方法27-29
• 2.4 miRNAs在骨骼肌發(fā)育中的作用29-32
• 2.4.1 肌肉組織特異性miRNAs29-30
• 2.4.2 肌肉組織特異性miRNAs在肌肉發(fā)育中的作用30-31
• 2.4.3 非肌肉組織特異性miRNAs在肌肉發(fā)育中的作用31-32
• 2.5 小結(jié)與展望32-34
• 實(shí)驗(yàn)部分34-112
• 第三章 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離鑒定和誘導(dǎo)分化34-46
• 3.1 材料和方法34-38
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)方法35-38
• 3.2 結(jié)果與分析38-43
• 3.2.1 牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化38-39
• 3.2.2 純化方法和冷凍保存條件對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的影響39-40
• 3.2.3 未分化牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定40-42
• 3.2.4 誘導(dǎo)分化后牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定42-43
• 3.3 討論43-45
• 3.3.1 牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)43-44
• 3.3.2 牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的誘導(dǎo)分化44
• 3.3.3 牛肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定44-45
• 3.4 小結(jié)45-46
• 第四章 堿性成纖維細(xì)胞生長因子對牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響46-54
• 4.1 材料與方法46-48
• 4.1.1 材料46-47
• 4.1.2 方法47-48
• 4.2 結(jié)果與分析48-52
• 4.2.1 生長培養(yǎng)基中添加bFGF對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響48-50
• 4.2.2 分化培養(yǎng)基中添加bFGF對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響50-52
• 4.3 討論52-53
• 4.3.1 生長培養(yǎng)基中添加bFGF對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響52-53
• 4.3.2 分化培養(yǎng)基中添加bFGF對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響53
• 4.4 小結(jié)53-54
• 第五章 牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化相關(guān)miRNAs的鑒定和生物信息學(xué)分析54-70
• 5.1 材料與方法55-58
• 5.1.1 材料55
• 5.1.2 方法55-58
• 5.2 結(jié)果與分析58-66
• 5.2.1 牛肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過程中差異表達(dá)mi RNAs的鑒定58-60
• 5.2.2 差異表達(dá)miRNAs的qRT-PCR驗(yàn)證60-61
• 5.2.3 成肌分化相關(guān)miRNAs的靶基因預(yù)測及功能網(wǎng)絡(luò)分析61-66
• 5.3 討論66-68
• 5.3.1 牛肌衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化過程中差異表達(dá)mi RNAs的鑒定66-67
• 5.3.2 成肌分化相關(guān)miRNAs的靶基因預(yù)測67-68
• 5.3.3 成肌分化相關(guān)miRNAs靶基因GO和KEGG分析68
• 5.4 小結(jié)68-70
• 第六章 miR-1/206對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用研究70-85
• 6.1 材料與方法71-74
• 6.1.1 材料71
• 6.1.2 方法71-74
• 6.2 結(jié)果與分析74-82
• 6.2.1 牛miR-1 和miR-206靶基因Pax7和HDAC4的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)74-77
• 6.2.2 牛肌衛(wèi)星細(xì)胞中Pax7和HDAC4基因的miR-1/206表達(dá)調(diào)控實(shí)驗(yàn)77-78
• 6.2.3 miR-1 和miR-206對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用78-82
• 6.3 討論82-84
• 6.3.1 牛肌衛(wèi)星細(xì)胞中Pax7和HDAC4基因的miR-1/206表達(dá)調(diào)控實(shí)驗(yàn)82-83
• 6.3.2 miR-1 和miR-206對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用83-84
• 6.4 小結(jié)84-85
• 第七章 miR-139對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用研究85-112
• 7.1 材料與方法87-92
• 7.1.1 材料87
• 7.1.2 方法87-92
• 7.2 結(jié)果與分析92-106
• 7.2.1 牛miR-139靶基因預(yù)測及雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)92-95
• 7.2.2 牛肌衛(wèi)星細(xì)胞分化前后IGF1R基因和N-ras基因的表達(dá)變化95-96
• 7.2.3 牛肌衛(wèi)星細(xì)胞中IGF1R基因和N-ras基因的mi R-139表達(dá)調(diào)控實(shí)驗(yàn)96-98
• 7.2.4 miR-139對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的調(diào)控作用98-101
• 7.2.5 miR-139對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞MAPK及PI3K/Akt信號通路的影響101-104
• 7.2.6 miR-139在失神經(jīng)肌肉萎縮中的作用104-106
• 7.3 討論106-110
• 7.3.1 miR-139對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的影響106-107
• 7.3.2 miR-139對牛肌衛(wèi)星細(xì)胞MAPK和PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用107-110
• 7.4 小結(jié)110-112
• 結(jié)論112-114
• 創(chuàng)新之處和進(jìn)一步研究課題114-115
• 參考文獻(xiàn)115-131
• 附錄131-135
• 致謝135-136
• 個(gè)人簡介136

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