本文關(guān)鍵詞：蘋果MdWRKY33基因在輪紋病抗性形成中的作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蘋果輪紋病是制約我國蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要病害之一,由致病真菌Botryosphaeria dothidea引起。該病菌不僅能夠侵染枝干,導(dǎo)致樹體衰弱,還能侵染果實(shí),形成同心輪紋病斑致果實(shí)腐爛；同時(shí)由于該病菌的潛伏特性,使蘋果輪紋病成為果實(shí)貯運(yùn)期的重要病害之一,致使蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)急劇下降,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。植物在與病原菌漫長的協(xié)同進(jìn)化過程中形成了極為復(fù)雜的抗病與免疫反應(yīng)機(jī)制,使其能夠針對特定病原菌的入侵而相應(yīng)地激發(fā)植物抗病反應(yīng)。經(jīng)典的植物病理學(xué)研究表明：植物抗?fàn)I活體寄生菌主要依賴于水楊酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,而抗?fàn)I腐體寄生菌主要依賴于茉莉酸／乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。輪紋病菌屬于兼性寄生菌,目前對該病菌與蘋果互作的分子機(jī)制研究以及該病菌入侵后引起的抗病反應(yīng)的研究,報(bào)道較少。因此,開展輪紋病菌與蘋果果實(shí)互作的分子機(jī)制研究,對蘋果抗病基因的挖掘、輪紋病菌防治機(jī)理的豐富和抗輪紋病新品種的培育均具有重要意義。本文以易感品種‘富士’果實(shí)為試材,首先研究了輪紋病菌B.dothidea在蘋果果實(shí)中的擴(kuò)展方式以及對蘋果果實(shí)細(xì)胞的傷害；其次研究了乙烯信號分子在蘋果果實(shí)發(fā)病中的作用,發(fā)現(xiàn)了乙烯在蘋果果實(shí)與輪紋病菌互作中作為致病因子,促進(jìn)果實(shí)發(fā)病；此外還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY33參與調(diào)控了蘋果病程相關(guān)基因MdPRs的表達(dá),并且介導(dǎo)了乙烯的致毒作用。主要研究結(jié)果如下：1.運(yùn)用半薄切片與掃描電鏡技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),B.dothidea侵入果實(shí)細(xì)胞后,菌絲大量存在于植物細(xì)胞壁與細(xì)胞間隙中。細(xì)胞壁降解為受B.dothidea侵染的蘋果果實(shí)細(xì)胞的典型受害癥狀；部分受害細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離；核染色質(zhì)濃縮并聚集于核膜上,呈典型細(xì)胞凋亡癥狀。2.乙烯在輪紋病發(fā)病過程中作為致毒因子促進(jìn)蘋果果實(shí)發(fā)病。對不同成熟度與生理狀態(tài)的三批果實(shí),即‘富士’幼果、新鮮成熟果實(shí)與儲(chǔ)藏果實(shí),接種輪紋病菌后,施用乙烯抑制劑1-MCP,能夠顯著抑制果實(shí)發(fā)病；1-MCP對病斑的抑制作用呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性,1-MCP濃度越高,抑制作用越明顯；相同濃度1-MCP對成熟果實(shí)病斑擴(kuò)展的抑制效果最好；用外源乙烯預(yù)處理能夠促進(jìn)果實(shí)病斑擴(kuò)展。3.在乙烯抑制劑1-MCP處理下,蘋果病程相關(guān)基因MdPRs的表達(dá)進(jìn)一步升高。B.dothidea能夠誘導(dǎo)‘富士’幼果和新鮮成熟果中MdPR-5、MdPR-8和MdPR-4基因的表達(dá),當(dāng)用1-MCP處理接菌果實(shí),病菌侵染誘導(dǎo)的MdPRs基因的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)；而在儲(chǔ)藏成熟果實(shí)中,輪紋病菌侵染卻抑制了MdPRs基因的表達(dá),1-MCP處理能夠完全逆轉(zhuǎn)輪紋病菌對MdPRs基因的抑制作用。此外,編碼幾丁質(zhì)酶的MdChiB-1基因在幼果中不被輪紋病菌誘導(dǎo),用1-MCP處理之后,其表達(dá)在輪紋病菌侵染下顯著升高；新鮮成熟果實(shí)在1-MCP處理下,該基因的表達(dá)在輪紋病菌侵染下也進(jìn)一步增強(qiáng);而在儲(chǔ)藏果實(shí)中,輪紋病菌對該基因的抑制作用被去除。因此,在1-MCP處理下,蘋果病程相關(guān)基因MdPRs表達(dá)水平進(jìn)一步升高,可能是增強(qiáng)蘋果抗病能力,限制病斑擴(kuò)展的重要因素。4.蘋果轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY33-1(MDP0000296025)的表達(dá)與病程相關(guān)基因MdPRs的表達(dá)高度協(xié)同。通過對19個(gè)轉(zhuǎn)錄因子做RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),B.dothidea只能誘導(dǎo)幼果中乙烯信號轉(zhuǎn)錄因子MdERF2的表達(dá)并且對幼果中MdERF3、MdERF98-3、MdERF98-6和MdERF98.7的誘導(dǎo)作用比對成熟果顯著,1-MCP處理能抑制B.dothidea對ERFs的誘導(dǎo)表達(dá)；只有轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY33-1的表達(dá)在接菌果實(shí)的乙烯合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被抑制時(shí),表達(dá)進(jìn)一步升高,與MdPRs表達(dá)變化高度協(xié)同——在幼果中變化不大,在成熟果中表達(dá)量進(jìn)一步升高,在儲(chǔ)藏果中的表達(dá)抑制被解除；在各種激素和過氧化物等非生物脅迫下, ‘嘎啦’組培苗中的MdWRKY33-1與MdChiB-1、MdPR-5、MdPR-8、 MaPR-4這些MdPRs的表達(dá)變化也表現(xiàn)出了高度協(xié)同。5.MdWRKY33-1過表達(dá)能提高病程相關(guān)蛋白基因MdPRs的表達(dá)。轉(zhuǎn)化蘋果原生質(zhì)體過表達(dá)ERFs和MdWRKY33轉(zhuǎn)錄因子,發(fā)現(xiàn)只有MdWRKY33-1能明顯提高M(jìn)dPRs的表達(dá),說明MdWRKY33-1對MdPRs的表達(dá)起調(diào)控作用。6.在蘋果果實(shí)中,輪紋病菌所誘導(dǎo)的乙烯合成途徑與果實(shí)成熟過程中的乙烯合成途徑不同。B.dothidea誘導(dǎo)的乙烯合成是通過影響MdACS5a,MdACS5b的表達(dá)來實(shí)現(xiàn),與蘋果果實(shí)成熟過程中乙烯的合成途徑不同(MdACS1,MdACS3)。通過RT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),負(fù)責(zé)介導(dǎo)由傷害脅迫引發(fā)的植物乙烯合成中的MdACS5a和MdACS5b基因的表達(dá),能被輪紋病菌顯著誘導(dǎo),但輪紋病菌不能誘導(dǎo)負(fù)責(zé)果實(shí)成熟過程中乙烯合成與躍變的MdACS1和MdACS3的表達(dá),說明B.dothidea誘導(dǎo)的果實(shí)乙烯合成與蘋果果實(shí)成熟過程中的乙烯合成不同。乙烯受體基因MdERS1、MdERS2只在幼果中被B.dothidea誘導(dǎo),在成熟果實(shí)中不被誘導(dǎo),1-MCP處理能夠抑制B.dothidea對它們的誘導(dǎo)作用；類似地,輪紋病菌對幼果乙烯受體基因MdETR2、乙烯轉(zhuǎn)錄因子MdERF98等的誘導(dǎo)比對成熟果顯著,1-MCP處理均能顯著抑制這些基因的表達(dá),表明B.dothidea誘導(dǎo)的乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控與果實(shí)成熟進(jìn)程有關(guān)。嚴(yán)格依賴乙烯的與果實(shí)成熟相關(guān)的MdPG1基因也能被輪紋病菌誘導(dǎo),并受1-MCP顯著抑制,進(jìn)一步證實(shí)蘋果果實(shí)響應(yīng)輪紋病菌的乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與果實(shí)成熟進(jìn)程有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：蘋果果實(shí) 輪紋病菌 乙烯 抗病性 MdWRKY33 MdPRs
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S436.611.1
【目錄】：

• 中英文縮略詞表5-11
• 中文摘要11-14
• Abstract14-17
• 1 前言17-40
• 1.1 蘋果輪紋病研究進(jìn)展17-22
• 1.1.1 蘋果輪紋病的發(fā)生與危害17-18
• 1.1.2 蘋果輪紋病菌的侵染過程及發(fā)病誘因18-19
• 1.1.3 病原菌致病機(jī)制19-20
• 1.1.4 植物抗病機(jī)制20-22
• 1.1.4.1 免疫反應(yīng)20-21
• 1.1.4.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病反應(yīng)中的作用21-22
• 1.2 乙烯在不同植病互作體系中的作用22-26
• 1.2.1 乙烯的調(diào)控在不同植病互作體系中具有不同的意義23-24
• 1.2.2 不同激素信號途徑的交叉作用24-25
• 1.2.3 乙烯在分子水平上的調(diào)控25-26
• 1.3 乙烯生物合成26-29
• 1.3.1 乙烯生物合成途徑及系統(tǒng)26
• 1.3.2 乙烯生物合成相關(guān)酶26-28
• 1.3.2.1 SAM合成酶和SAM水解酶26-27
• 1.3.2.2 ACC合成酶和ACC氧化酶27-28
• 1.3.3 蘋果乙烯生物合成研究進(jìn)展28-29
• 1.4 乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)29-34
• 1.4.1 乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)線性模型建立29
• 1.4.2 乙烯受體及其對乙烯信號的感知29-30
• 1.4.3 乙烯在胞質(zhì)內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)30-31
• 1.4.3.1 CTR1的功能30
• 1.4.3.2 EIN2的功能30-31
• 1.4.4 乙烯在核內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)31-33
• 1.4.4.1 初級轉(zhuǎn)錄因子(EIN3/EIL)31
• 1.4.4.2 次級轉(zhuǎn)錄因子(ERF/AP2)的結(jié)構(gòu)功能及對病原菌的響應(yīng)31-33
• 1.4.5 蘋果乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究進(jìn)展33-34
• 1.5 病程相關(guān)蛋白基因34-39
• 1.5.1 病程相關(guān)蛋白的分類與功能35-36
• 1.5.2 蘋果中病程相關(guān)蛋白的研究進(jìn)展36-39
• 1.5.2.1 MdPR-436-37
• 1.5.2.2 MdPR-1a,MdPR-5和MdPR-837-39
• 1.6 研究的目的和意義39
• 1.7 研究的主要內(nèi)容39-40
• 2 材料和方法40-54
• 2.1 試驗(yàn)材料40-43
• 2.1.1 植物材料40
• 2.1.2 蘋果輪紋病病原菌Botryospheria dothidea40
• 2.1.3 菌株和質(zhì)粒40
• 2.1.4 酶及生化試劑40
• 2.1.5 PCR引物40-41
• 2.1.6 培養(yǎng)基41-42
• 2.1.7 抗生素42
• 2.1.8 溶液配制42-43
• 2.1.8.1 MS培養(yǎng)基配制所用溶液42
• 2.1.8.2 質(zhì)粒DNA提取所用溶液42
• 2.1.8.3 原生質(zhì)體分離與轉(zhuǎn)化所用溶液42-43
• 2.1.8.4 Western Blot所用溶液43
• 2.2 試驗(yàn)方法43-54
• 2.2.1 蘋果輪紋病病原菌Botryospheria dothidea的培養(yǎng)與保存43-44
• 2.2.2 乙烯釋放量的測定44
• 2.2.3 半薄切片制片與掃描電鏡觀察44
• 2.2.4 總RNA提取44-46
• 2.2.5 反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成46
• 2.2.6 基因組DNA的提取及純化46-47
• 2.2.7 普通PCR反應(yīng)47
• 2.2.8 Real-time PCR47-48
• 2.2.9 基因克隆PCR48
• 2.2.10 PCR產(chǎn)物的回收48-49
• 2.2.11 連接反應(yīng)49
• 2.2.12 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化49-50
• 2.2.12.1 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備49-50
• 2.2.12.2 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化50
• 2.2.13 DNA序列測定50
• 2.2.14 序列分析50
• 2.2.15 質(zhì)粒DNA提取50-51
• 2.2.16 質(zhì)粒DNA酶切51
• 2.2.17 原生質(zhì)體的分離與轉(zhuǎn)化51-52
• 2.2.18 Western Blot52-54
• 2.2.18.1 蛋白樣品的制備52
• 2.2.18.2 SDS-PAGE電泳52
• 2.2.18.3 轉(zhuǎn)膜52-53
• 2.2.18.4 免疫反應(yīng)53
• 2.2.18.5 顯影與定影(暗室操作)53
• 2.2.18.6 凝膠圖像分析53-54
• 3 結(jié)果與分析54-80
• 3.1 輪紋病菌侵染后蘋果細(xì)胞學(xué)研究54-59
• 3.1.1 輪紋病菌對蘋果果實(shí)細(xì)胞壁的影響54-56
• 3.1.2 輪紋病菌對蘋果果實(shí)細(xì)胞器的影響56-58
• 3.1.3 輪紋病菌對蘋果果實(shí)細(xì)胞核的影響58-59
• 3.2 輪紋病菌對蘋果果實(shí)MAPK活性的影響59-60
• 3.3 乙烯與蘋果輪紋病的關(guān)系60-68
• 3.3.1 1-MCP對接種輪紋病菌果實(shí)乙烯生物合成和病斑大小的影響60-62
• 3.3.2 1-MCP對乙烯生物合成和乙烯信號感知相關(guān)基因的影響62-66
• 3.3.3 1-MCP對病程相關(guān)基因MdPRs的影響66-68
• 3.4 MdWRKY33的表達(dá)受乙烯負(fù)調(diào)控68-75
• 3.4.1 1-MCP對轉(zhuǎn)錄因子的影響68-73
• 3.4.2 外源乙烯對MdWRKY33的影響73-75
• 3.5 MdWRKY33與MdPRs的關(guān)系75-80
• 3.5.1 MdWRKY33與MdPRs的表達(dá)高度協(xié)同75-76
• 3.5.2 MdPRs啟動(dòng)子分析76-78
• 3.5.3 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化驗(yàn)證78-80
• 4 討論80-90
• 4.1 輪紋病菌在蘋果果實(shí)中的侵染方式及致病機(jī)制80-82
• 4.1.1 輪紋病菌在蘋果果實(shí)中的擴(kuò)展方式及對果實(shí)細(xì)胞壁的破壞80-81
• 4.1.2 線粒體對病菌侵染較為敏感81-82
• 4.1.3 輪紋病菌誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡82
• 4.2 乙烯與蘋果輪紋病的關(guān)系82-86
• 4.2.1 乙烯促進(jìn)蘋果輪紋病菌發(fā)病82-84
• 4.2.2 蘋果輪紋病菌誘導(dǎo)的乙烯信號途徑與果實(shí)成熟進(jìn)程有交叉作用84-86
• 4.3 MdWRKY33介導(dǎo)乙烯對MdPRs的負(fù)調(diào)控86-88
• 4.3.1 MdWRKY33與MdPRs表達(dá)高度協(xié)同86-87
• 4.3.2 MdWRKY33調(diào)控MdPRs的表達(dá)87-88
• 4.4 MdWRKY33調(diào)控MdPRs的猜測模型88-90
• 5 結(jié)論90-91
• 6 創(chuàng)新點(diǎn)91-92
• 7 參考文獻(xiàn)92-117
• 8 附錄117-124
• 8.1 取樣示意圖117
• 8.2 熒光定量所用引物117-121
• 8.3 構(gòu)建載體所用引物121-122
• 8.4 補(bǔ)充圖表122-124
• 9 致謝124-125
• 10 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況125

  本文關(guān)鍵詞：蘋果MdWRKY33基因在輪紋病抗性形成中的作用機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：363800