本文關(guān)鍵詞：Myostatin蛋白功能性失活小鼠模型的建立與相關(guān)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：Myostatin是骨骼肌生長的負(fù)調(diào)控因子,myostatin功能性失活可以顯著提高動(dòng)物的生長速度和產(chǎn)肉率,因此它是家畜基因工程育種中的重要候選基因。在小鼠等物種的研究表明,有兩種方式可以有效滅活myostatin功能而產(chǎn)生肌肉過度生長的表型：一種是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動(dòng)物體內(nèi)過表達(dá)myostatin的抑制蛋白,如myostatin前肽；另一種方式是通過基因敲除技術(shù)剔除myostatin基因。綿羊是畜牧生產(chǎn)中的主要家畜之一,其肉、毛是極其重要的經(jīng)濟(jì)性狀,利用基因工程手段改良其肉用表型對(duì)培育優(yōu)質(zhì)綿羊新品種具有重要實(shí)際意義。因此,本論文以小鼠模型研究了過表達(dá)綿羊myostatin前肽和敲除myostatin基因?qū)π∈蠹∪馍L等表型的影響,為今后綿羊的基因工程育種提供依據(jù)和參考。主要研究結(jié)果如下： 1.在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)過表達(dá)綿羊myostatin前肽 首先通過實(shí)驗(yàn)克隆獲得了綿羊]myostatin前肽的cDNA序列,并對(duì)序列進(jìn)行了點(diǎn)突變以增強(qiáng)其抑制功能。首先通過A204細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)證明,過表達(dá)的綿羊]myostatin前肽可以有效降低細(xì)胞內(nèi)源性myostatin活性,然后通過小鼠體內(nèi)質(zhì)粒注射實(shí)驗(yàn)證實(shí),肌肉內(nèi)注射綿羊myostatin前肽表達(dá)質(zhì)粒可以誘發(fā)體重增加和肌纖維肥大的表型。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建四環(huán)素可誘導(dǎo)的、肌肉特異性表達(dá)綿羊myostatin前肽基因的載體,并生產(chǎn)了轉(zhuǎn)基因小鼠。該誘導(dǎo)載體在體外細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)均能實(shí)現(xiàn)依賴于四環(huán)素的可誘導(dǎo)表達(dá)模式,且表達(dá)嚴(yán)謹(jǐn)性和組織特異性效果很好。之后檢驗(yàn)了轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉生長表型,發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)myostain前肽不能產(chǎn)生體重增加和肌重增加的表型,但可以誘導(dǎo)肌纖維肥大的表型。由此,通過上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)了通過可控的myostatin前肽過表達(dá)可以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)myostatin功能性失活,這對(duì)于將其應(yīng)用到綿羊基因工程育種中提供了有價(jià)值的參考。 2.敲除小鼠的myostatin基因 首先利用最新發(fā)展起來的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)小鼠myostatin基因進(jìn)行了敲除,同時(shí)還一次性敲除了另一個(gè)與毛發(fā)生長相關(guān)的基因—成纖維細(xì)胞生長因子5(FGF5)。首先通過多物種的序列比對(duì),在myostatin和fgf5基因的高度保守區(qū)域選擇靶位點(diǎn)并設(shè)計(jì)了sgRNA,然后通過原核顯微注射生產(chǎn)了：myostatin和fgt3突變小鼠,結(jié)果表明,出生的小鼠中雙基因敲除效率達(dá)到20%,且沒有明顯脫靶效應(yīng)。隨后通過對(duì)基因敲除小鼠的表型進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,敲除myostatin的小鼠表現(xiàn)出體重增加和肌肉過度生長等表型；敲除fgf5的小鼠表現(xiàn)出被毛過度生長的表型。Myostatin/fgf5同時(shí)敲除的小鼠也表現(xiàn)出與單個(gè)基因敲除類似的表型,但myostatin/fgf5同時(shí)敲除的小鼠幼年期體型偏小且存活率較低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),myostatin和fgt3基因間存在相互影響,在雙突變的情況下可能會(huì)影響小鼠出生后的生長發(fā)育或體內(nèi)能量代謝。本研究表明,利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時(shí)敲除myostatin和fgf5基因的方案是高效并可行的,這為綿羊等家畜的基因敲除并進(jìn)而改良綿羊肉、毛表型提供了借鑒。 綜上,本論文利用轉(zhuǎn)基因和基因敲除兩種技術(shù)在兩種小鼠模型上分別評(píng)估了綿羊myostatin前肽和myostatin/fgf5敲除對(duì)肌肉生長等表型的影響,研究結(jié)果為這些技術(shù)今后應(yīng)用于綿羊等家畜的基因工程育種奠定了技術(shù)基礎(chǔ)和提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：綿羊 myostatin 轉(zhuǎn)基因 可誘導(dǎo)表達(dá) CRISPR/Cas9 FGF5 基因敲除
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S826
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 目錄7-8
• ~.略語表8-9
• 第一章 引言9-37
• 第一節(jié) Myostatin基因的研究進(jìn)展9-18
• 第二節(jié) FGF5基因的研究進(jìn)展18-20
• 第三節(jié) 轉(zhuǎn)基因與基因打靶20-26
• 第四節(jié) 新的基因修飾技術(shù)26-37
• 第二章 研究報(bào)告37-91
• 第一部分 綿羊myostatin前肽的組織特異性可誘導(dǎo)表達(dá)小鼠模型的建立及相關(guān)研究37-66
• 1 引言37
• 2 材料與方法37-54
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析54-64
• 4 討論64-66
• 第二部分 Myostatin和FGF5雙基因敲除小鼠模型的建立與相關(guān)研究66-91
• 1 引言66
• 2 材料與方法66-76
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析76-89
• 4 討論89-91
• 第三章 結(jié)論91-92
• 參考文獻(xiàn)92-109
• 致謝109-110
• 作者簡歷110

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 ;Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J];遺傳學(xué)報(bào);2012年05期

2 Charles Ashton;;Rapid and Cost-Effective Gene Targeting in Rat Embryonic Stem Cells by TALENs[J];遺傳學(xué)報(bào);2012年06期

  本文關(guān)鍵詞：Myostatin蛋白功能性失活小鼠模型的建立與相關(guān)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：363020