本文關(guān)鍵詞：大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)S.suis體外生物被膜QS系統(tǒng)及毒力因子的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬鏈球菌是引起豬腦膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎等威脅生命疾病的重要病原。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為,豬鏈球菌在動(dòng)物體內(nèi)外可以形成生物被膜(biofilm,BF),細(xì)菌生物被膜(bacterial biofilm)是細(xì)菌利用自身分泌的含水聚合物質(zhì)粘附成團(tuán),附著于固體物質(zhì)表面的具有特殊微結(jié)構(gòu)的細(xì)菌群落。近年來,細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重,隨著對(duì)生物膜研究的深入,發(fā)現(xiàn)細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性不僅與耐藥菌株的大量產(chǎn)生有關(guān),亦與致病菌在體內(nèi)形成生物膜有關(guān)。當(dāng)細(xì)菌在體內(nèi)形成生物膜后,細(xì)菌群體耐藥性極強(qiáng),不僅可以逃避宿主免疫作用,且感染部位難以徹底清除,是臨床上難治性感染的重要原因之一。生物被膜作為細(xì)菌的一種重要生存方式,受多種因素的影響和調(diào)節(jié)。其中,密度體感應(yīng)(quorum sensing,QS)現(xiàn)象就是近年來發(fā)現(xiàn)的對(duì)生物被膜產(chǎn)生重要作用的影響因素之一。大環(huán)內(nèi)酯類藥物(Macrolides)在體外亞-MIC濃度下顯示了對(duì)銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)等生物被膜形成的抑制作用,但尚未有關(guān)于亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物對(duì)豬鏈球菌生物被膜形成的影響及其調(diào)控機(jī)制的研究,故在本研究中,利用卡爾加里生物被膜裝置(CBD)成功的獲得了豬鏈球菌體外生物被膜,采用掃描電鏡和微孔板結(jié)晶紫染色法從定性和定量?jī)蓚�(gè)角度闡明亞-MIC濃度的三種大環(huán)內(nèi)酯類藥物(紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素)對(duì)豬鏈球菌ATCC700794生物被膜的影響。通過蛋白質(zhì)組學(xué)i TRAQ技術(shù)分析1/4MIC大環(huán)內(nèi)酯類藥物(紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素)干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成前后差異蛋白,尋找大環(huán)內(nèi)酯類藥物作用的蛋白靶點(diǎn),并通過Real time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)群體感應(yīng)有關(guān)的差異蛋白的基因及豬鏈球菌毒力基因的變化,從分子水平驗(yàn)證大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)密度感應(yīng)系統(tǒng)相關(guān)蛋白和毒力基因的影響。說明群體感應(yīng)系統(tǒng)、生物被膜形成和毒力因子之間的關(guān)系,為臨床治療生物被膜感染提供理論依據(jù)。研究的主要結(jié)果如下:(1)通過卡里加里生物被膜裝置(CBD)成功獲得的豬鏈球菌體外生物被膜,掃描電鏡和結(jié)晶紫染色鑒定了生物被膜形成周期,其在72h時(shí)處于成熟期。(2)亞-MIC大環(huán)內(nèi)酯類藥物(紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素)干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成,結(jié)晶紫染色進(jìn)行生物被膜定量分析,結(jié)果顯示在1/2和1/4MIC濃度時(shí)對(duì)生物被膜干預(yù)效果明顯。(3)通過蛋白質(zhì)組學(xué)i TRAQ技術(shù),對(duì)1/4MIC濃度的大環(huán)內(nèi)酯類藥物(紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素)干預(yù)的豬鏈球菌生物被膜形成進(jìn)行蛋白質(zhì)組定量分析,按ratio1.2 or0.8(p-value0.05)進(jìn)行蛋白質(zhì)篩選,結(jié)果顯示紅霉素干預(yù)后,上調(diào)蛋白55個(gè),下調(diào)蛋白24個(gè);阿奇霉素干預(yù)后,上調(diào)蛋白82個(gè),下調(diào)蛋白92個(gè);泰樂菌素干預(yù)后,上調(diào)蛋白105個(gè),下調(diào)蛋白66個(gè)。與群體感應(yīng)系統(tǒng)有關(guān)膜蛋白ABC superfamily ATP binding cassette transporter(基因com AB編碼)均表達(dá)上調(diào)。(4)通過Real time RT-PCR方法比較1/4MIC紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素干預(yù)下的豬鏈球菌QS系統(tǒng)相關(guān)基因com AB及毒力基因的表達(dá)。亞-MIC紅霉素干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成后,QS系統(tǒng)中com AB及毒力基因中g(shù)dh、fbps、ef表達(dá)上調(diào),cps表達(dá)下調(diào),其他基因表達(dá)無(wú)差異。亞-MIC阿奇霉素干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成后,QS系統(tǒng)中com AB及毒力基因中cps、mrp、ef表達(dá)上調(diào),gdh、sly表達(dá)下調(diào),其他基因表達(dá)無(wú)差異。亞-MIC泰樂菌素抑制豬鏈球菌生物被膜形成后,QS系統(tǒng)中com AB表達(dá)上調(diào),毒力基因gdh、sly、cps、gapdh、fbps、mrp和ef表達(dá)下調(diào)。提示密度感應(yīng)系統(tǒng)與毒力基因有一定的相關(guān)性。本課題研究結(jié)果顯示,大環(huán)內(nèi)酯類藥物(紅霉素、阿奇霉素、泰樂菌素)在亞-MIC濃度下,對(duì)豬鏈球菌ATCC700794生物被膜的形成具有干預(yù)作用,其對(duì)豬鏈球菌密度感應(yīng)系統(tǒng)、生物被膜和毒力基因有一定的影響。說明密度感應(yīng)系統(tǒng)、生物被膜形成和毒力基因有一定的相關(guān)性。目前對(duì)亞-MIC抗菌藥物對(duì)細(xì)菌生物被膜和毒力因子的調(diào)控還知之甚少,尚有許多未知的作用存在,因此,本研究進(jìn)行大量相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室研究,可為臨床抗菌藥物在使用時(shí)趨利避害,合理應(yīng)用提供有價(jià)值的參考,也可通過細(xì)菌生物被膜相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究,為有效地防控細(xì)菌生物被膜感染提供有力的幫助。
【關(guān)鍵詞】：豬鏈球菌生物被膜 QS系統(tǒng) 毒力因子 大環(huán)內(nèi)酯類藥物 i TRAQ
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S859.79
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-13
• 1 引言13-27
• 1.1 細(xì)菌生物被膜研究進(jìn)展13-18
• 1.1.1 生物被膜的結(jié)構(gòu)與特征14-15
• 1.1.2 細(xì)菌生物被膜的形成及致病15-17
• 1.1.3 細(xì)菌生物被膜的耐藥性與防治17-18
• 1.2 豬鏈球菌2型的毒力因子18-20
• 1.3 細(xì)菌的QS系統(tǒng)對(duì)生物被膜的影響20-21
• 1.4 大環(huán)內(nèi)酯類藥物的研究進(jìn)展21-24
• 1.4.1 對(duì)粘附的抑制作用22
• 1.4.2 對(duì)毒力因子的抑制作用22
• 1.4.3 對(duì)生物被膜的抑制作用22-23
• 1.4.4 對(duì)群體感應(yīng)的抑制23-24
• 1.5 細(xì)菌生物被膜實(shí)驗(yàn)方法的研究進(jìn)展24-25
• 1.5.1 生物被膜模型24
• 1.5.2 細(xì)菌生物被膜的鑒定方法24-25
• 1.6 研究目的與意義25-27
• 2 材料和方法27-36
• 2.1 材料27-29
• 2.1.1 菌株27
• 2.1.2 藥品27
• 2.1.3 培養(yǎng)基及試劑27
• 2.1.4 儀器設(shè)備27-28
• 2.1.5 Real time RT-PCR所需引物28-29
• 2.2 方法29-36
• 2.2.1 豬鏈球菌生物被膜形成及其測(cè)定29-30
• 2.2.2 大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)豬鏈球菌抗菌活性的研究30-31
• 2.2.3 大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)豬鏈球菌生物被膜形成的干預(yù)作用31
• 2.2.4 樣品制備31-32
• 2.2.5 酶解和肽段定量32
• 2.2.6 肽段標(biāo)記32
• 2.2.7 SCX分級(jí)32
• 2.2.8 質(zhì)譜分析32-33
• 2.2.9 數(shù)據(jù)分析33-34
• 2.2.10 細(xì)菌RNA提取及Real time RT-PCR34-35
• 2.2.11 數(shù)據(jù)分析采用35-36
• 3 結(jié)果與分析36-63
• 3.1 生物被膜形成能力的測(cè)定36
• 3.2 豬鏈球菌生物被膜的超微結(jié)構(gòu)36-37
• 3.3 大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)豬鏈球菌生物被膜形成的干預(yù)作用37-39
• 3.4 亞抑菌濃度大環(huán)內(nèi)酯類藥物干預(yù)生物被膜形成蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果39-60
• 3.4.1 蛋白質(zhì)定量結(jié)果39
• 3.4.2 SDS-PAGE電泳39-40
• 3.4.3 酶解肽段濃度測(cè)定40
• 3.4.4 肽段SCX分級(jí)40-41
• 3.4.5 生物信息學(xué)分析41-44
• 3.4.6 蛋白質(zhì)組學(xué)分析44-45
• 3.4.7 三組差異蛋白的詳細(xì)信息45-60
• 3.4.8 QS系統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)分析60
• 3.5 QS系統(tǒng)及毒力相關(guān)基因的體外定量分析60-63
• 4 討論63-71
• 4.1 生物被膜體外模型建立63
• 4.2 生物被膜形成的鑒定63-64
• 4.3 大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)生物被膜形成的影響64
• 4.4 亞-MIC濃度的大環(huán)內(nèi)酯類藥物干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成蛋白質(zhì)組學(xué)分析64-67
• 4.4.1 紅霉素干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成的差異蛋白64-66
• 4.4.2 阿奇霉素干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成的差異蛋白66-67
• 4.4.3 泰樂菌素干預(yù)豬鏈球菌生物被膜形成的差異蛋白67
• 4.5 大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)豬鏈球菌QS系統(tǒng)及生物被膜的影響67-68
• 4.6 亞MIC大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)S. suis毒力因子的影響68-71
• 5 結(jié)論71-72
• 致謝72-73
• 參考文獻(xiàn)73-83
• 附錄83-103
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文103

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  本文關(guān)鍵詞：大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)S.suis體外生物被膜QS系統(tǒng)及毒力因子的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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