乳腺是哺乳動(dòng)物特有的可泌乳的分泌型器官,乳腺上皮細(xì)胞是體外研究乳腺生理功能的重要模型,是體內(nèi)泌乳系統(tǒng)細(xì)胞的典型代表。泌乳性狀作為奶山羊重要的性狀之一,研究乳汁主要成分乳蛋白和乳脂形成的分子機(jī)制可為奶山羊分子育種提供理論依據(jù),加快育種進(jìn)程。MiRNA是一類多靶點(diǎn)的非編碼RNA,通過種子位點(diǎn)與靶基因結(jié)合,對(duì)靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,繼而參與多種生物進(jìn)程。MiRNA在不同泌乳時(shí)期的差異表達(dá)顯示miRNA在調(diào)節(jié)泌乳性狀方面發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究顯示奶山羊乳腺中novel-miR-3880在奶山羊泌乳高峰期的表達(dá)量較高,有報(bào)道指出泌乳高峰期乳腺中代謝速率明顯加快,底物攝取增加,蛋白和脂質(zhì)合成增多,由此推測novel-miR-3880在乳腺發(fā)育和乳合成中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。環(huán)狀RNA是一類可變剪切產(chǎn)生的共價(jià)閉環(huán)非編碼RNA,有多個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn),可作為miRNA分子海綿與miRNA靶基因產(chǎn)生競爭性結(jié)合,從而減弱miRNA對(duì)靶基因的調(diào)節(jié)作用。然而,novel-miR-3880和環(huán)狀RNA在奶山羊泌乳分子機(jī)制方面研究較少。本課題組前期通過高通量測序建立了奶山羊環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫,通過生物信息學(xué)分析,預(yù)... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：108 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

乳腺泌乳過程

織差異表達(dá)檢測。2.2.2.2小鼠活體試驗(yàn)及樣品采集選取年齡、體重、胎次、仔鼠數(shù)和仔鼠重相近的同一天產(chǎn)仔的小鼠18只，分為3組，每組6只，飼養(yǎng)于SPF環(huán)境中，提供自由飲食和自由飲水，正常哺乳，產(chǎn)后第3天開始注射處理以免引起應(yīng)激過大導(dǎo)致小鼠死亡，試驗(yàn)過程每窩小鼠分籠飼養(yǎng)，保證其生存環(huán)境，并每天更換墊料、水和食物。合成的novel-miR-3880agomir和ELF2siRNA（siELF2）用生理鹽水稀釋，對(duì)照組注射等量的生理鹽水，試驗(yàn)組以10nmol/次/只的劑量注射，間隔3天或4天注射一次，第22天收集母鼠乳腺組織和血樣，試驗(yàn)過程概要如圖2-1所示。圖2-1小鼠處理示意圖Figure2-1Schematicdiagramofmicetreatment2.2.3細(xì)胞培養(yǎng)參照Wang等(Wang,Luoetal.2010)的方法分離純化奶山羊乳腺上皮細(xì)胞并采用免疫熒光技術(shù)進(jìn)行鑒定。純化好的細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液配方為DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10%的胎牛血清和雙抗。細(xì)胞傳代時(shí)棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗細(xì)胞三次后加入胰蛋白酶細(xì)胞消化液，待細(xì)胞變圓時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，并輕輕吹打成均勻的細(xì)胞懸液，一分為二，繼續(xù)置于37℃CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)保持濕潤環(huán)境。2.2.4細(xì)胞小RNA轉(zhuǎn)染本研究所有的小RNA序列見附錄三。按照LipofectamineRNAiMAXReagent（Invitrogen）轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染試劑的體積為小RNA體積的三倍，分別加入無血清培養(yǎng)基中配置好后將小RNA溶液加入轉(zhuǎn)染試劑溶液中，輕輕混勻，室溫孵育5分鐘，加入細(xì)胞中搖勻即可。2.2.5轉(zhuǎn)錄組生物信息學(xué)分析2.2.5.1RNA提取按照Trizol試劑說明書提取RNA，具體步驟見附錄四，提取的RNA用于轉(zhuǎn)錄組測序或RT-qPCR，轉(zhuǎn)錄組測序中RNA質(zhì)量用Agilentbioanalyzer2100芯片生物分析

第二章山羊novel-miR-3880下游差異基因的篩選及其對(duì)乳腺發(fā)育的調(diào)控作用23圖2-2Novel-miR-3880差異基因篩選及驗(yàn)證Figure2-2Screeninganddetectionofdifferentiallyexpressedgenes（DEGs）ofnovel-miR-3880（a）Novel-miR-3880差異基因在火山圖中的顯示；（b）Novel-miR-3880差異基因數(shù)量；（c）測序結(jié)果中10個(gè)差異基因?qū)崟r(shí)定量PCR驗(yàn)證（a）Novel-miR-3880DEGsinvolcanoplot；（b）Numberofnovel-miR-3880DEGs；（c）RT-qPCRdetectionof10DEGs2.3.2Novel-miR-3880下游差異基因GO富集分析對(duì)獲得的67個(gè)差異基因進(jìn)行GO注釋，并以參與的生物過程、基因的分子功能和細(xì)胞組分進(jìn)行基因功能分類，富集結(jié)果顯示novel-miR-3880參與23個(gè)細(xì)胞代謝途徑，包括8個(gè)生物進(jìn)程相關(guān)代謝途徑、5個(gè)分子功能相關(guān)代謝途徑和10個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)代謝途徑（圖2-3）。其中富集下游差異基因最多的代謝進(jìn)程集中在生物進(jìn)程，包括免疫系統(tǒng)進(jìn)程（GO:0002376）、應(yīng)激反應(yīng)（GO:0050896）、細(xì)胞進(jìn)程（GO:0009987）和單有機(jī)體代謝進(jìn)程（GO:0008152）等。


本文編號(hào)：3578617