本文關(guān)鍵詞：基于遺傳編碼非天然氨基酸技術(shù)的β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留檢測(cè)方法的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：食品安全關(guān)系大眾健康,是國(guó)家穩(wěn)定發(fā)展的基礎(chǔ),隨著我國(guó)居民飲食中動(dòng)物源性食品占比不斷增加,相關(guān)產(chǎn)品中抗生素殘留已成為影響食品安全的主要形式之一。p-內(nèi)酰胺類抗生素在獸藥臨床應(yīng)用廣泛,建立一種靈敏、穩(wěn)定、簡(jiǎn)單的檢測(cè)方法監(jiān)控其在動(dòng)物源性食品中的殘留,是解決食品安全問題的重要手段。本文以青霉素結(jié)合蛋白(PBP2x)為研究對(duì)象,利用“遺傳編碼非天然氨基酸技術(shù)(UaaTech)"將熒光氨基酸7HC ((7-hydroxycoumarin-4-yl) ethylglycine)引入到PBP2x底物結(jié)合區(qū)域的不同位點(diǎn),經(jīng)過多條件優(yōu)化,成功于大腸桿菌中獲得了定點(diǎn)插入7HC的重組蛋白PBP2x_7HC(W374U和Y561U),產(chǎn)率達(dá)mg/L,并用質(zhì)譜分析確證。系統(tǒng)研究了W374U結(jié)合15種β-內(nèi)酰胺類抗生素前后的熒光光譜,發(fā)現(xiàn)其結(jié)合青霉素類抗生素后,用325nm激發(fā),發(fā)射光強(qiáng)度明顯增強(qiáng),用366nm激發(fā),發(fā)射光強(qiáng)度顯著降低；而當(dāng)其結(jié)合頭孢菌素類抗生素后,在以上兩種激發(fā)波長(zhǎng)下,發(fā)射光強(qiáng)統(tǒng)一減弱。本研究將W374U固定在微孔板中,分別以366nm和450nm做為激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng),建立β-內(nèi)酰胺類抗生素?zé)晒夥治龇�。該方法�?duì)青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、氯唑西林、苯唑西林、雙氯西林、頭孢噻呋、頭孢喹肟、頭孢洛寧、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢匹林和頭孢乙腈的最低檢測(cè)限分別為0.49～2.44 ng/mL,均低于歐盟最大殘留限量(MRL),且檢測(cè)范圍良好,回歸方程確定性系數(shù)R20.99。添加了抗生素的牛奶樣本經(jīng)過簡(jiǎn)單的前處理即可進(jìn)行檢測(cè),原奶中回收率為78%～102%,成品奶中回收率為76%-112%。并以阿莫西林為標(biāo)準(zhǔn)品,建立了p-內(nèi)酰胺類抗生素多殘留篩選方法,檢測(cè)限設(shè)為3.6 ng/mL,青霉素G等13種藥物以MRL添加在牛奶樣本中,均可檢出為陽性。對(duì)采集的6個(gè)原奶樣和超市購(gòu)買的9個(gè)純牛奶樣進(jìn)行檢測(cè),并與市售p-內(nèi)酰胺類檢測(cè)卡測(cè)試結(jié)果對(duì)比,二者完全一致。為進(jìn)一步提高W374U的產(chǎn)率,我們首次從蛋白組水平研究了UaaTech對(duì)表達(dá)宿主的影響,發(fā)現(xiàn)面對(duì)琥珀抑制子壓力時(shí),大腸桿菌首先是通過轉(zhuǎn)座子的插入突變來使得相關(guān)壓力基因失效；當(dāng)轉(zhuǎn)座未命中目標(biāo)而壓力持續(xù)時(shí),多達(dá)51種內(nèi)源蛋白表達(dá)會(huì)有超過2倍的改變。這些結(jié)果為提高W374U產(chǎn)率和突破UaaTech的局限發(fā)掘了新的思路�？傊�,本論文利用UaaTech技術(shù)創(chuàng)新地將殘留檢測(cè)的捕獲物和信號(hào)物統(tǒng)一為一個(gè)試劑,建立了靈敏的熒光分析法來檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素,具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,同時(shí)示范了一種檢測(cè)痕量小分子化合物的非競(jìng)爭(zhēng)性受體分析法,是獸藥殘留檢測(cè)方法的有益擴(kuò)充。
【關(guān)鍵詞】：β-內(nèi)酰胺類抗生素 殘留檢測(cè) 非天然氨基酸 青霉素結(jié)合蛋白 熒光
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S859.84
【目錄】：

• 摘要4-5
• abstract5-10
• 縮略詞10-11
• 名詞解釋11-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-32
• 1 研究目的和意義12-13
• 2 β-內(nèi)酰胺類抗生素概述13-17
• 2.1 β-內(nèi)酰胺類抗生素及其分類13-15
• 2.2 作用機(jī)理及獸醫(yī)臨床應(yīng)用15-17
• 3 β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展17-20
• 3.1 微生物檢測(cè)法18-19
• 3.2 理化檢測(cè)法19
• 3.3 免疫分析法19-20
• 4 遺傳編碼非天然氨基酸技術(shù)概述20-29
• 4.1 技術(shù)的簡(jiǎn)介及其原理20-24
• 4.2 技術(shù)的應(yīng)用24-29
• 5 熒光氨基酸7HC簡(jiǎn)介29-31
• 6 研究的內(nèi)容和方法31-32
• 第二章 帶熒光氨基酸的青霉素結(jié)合蛋白(PBP2x_7HC)的表達(dá)純化32-58
• 1 實(shí)驗(yàn)材料32-35
• 1.1 試劑32-33
• 1.2 溶液系統(tǒng)33-34
• 1.3 菌株34
• 1.4 儀器設(shè)備34-35
• 2 方法35-44
• 2.1 青霉素結(jié)合蛋白PBP2x表達(dá)載體的構(gòu)建35-38
• 2.2 PBP2x_W374TAG,PBP2x_Y561TAG表達(dá)載體構(gòu)建38-40
• 2.3 正交tRNA及氨酰tRNA合成酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建40-41
• 2.4 PBP2x_7HC表達(dá)測(cè)試41-42
• 2.5 PBP2x_7HC表達(dá)優(yōu)化42-43
• 2.6 PBP2x_7HC大量生產(chǎn)和鑒定43-44
• 3 結(jié)果44-54
• 3.1 PBP2x目的基因的擴(kuò)增45
• 3.2 PBP2x表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定45-46
• 3.3 PBP2x_W374TAG,PBP2x_Y561TAG表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定46
• 3.4 7HC氨酰tRNA合成酶基因的擴(kuò)增46-47
• 3.5 正交tRNA及氨酰tRNA合成酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定47-48
• 3.6 PBP2x_7HC表達(dá)測(cè)試48-49
• 3.7 PBP2x_7HC表達(dá)優(yōu)化49-52
• 3.8 PBP2x_7HC大量表達(dá)和純化52-53
• 3.9 PBP2x_7HC的理化分析53-54
• 3.10 PBP2x_7HC的質(zhì)譜分析54
• 4 分析與討論54-56
• 4.1 非天然氨基酸插入位點(diǎn)的選擇54-55
• 4.2 PBP2x_7HC的表達(dá)和優(yōu)化55-56
• 4.3 PBP2x_7HC大量生產(chǎn)的展望56
• 5 小結(jié)56-58
• 第三章 基于PBP2x_7HC的β-內(nèi)酰胺類抗生素?zé)晒鈾z測(cè)法的建立58-77
• 1 實(shí)驗(yàn)材料58-60
• 1.1 標(biāo)準(zhǔn)品58
• 1.2 試劑58-59
• 1.3 奶樣59
• 1.4 溶液系統(tǒng)59-60
• 1.5 儀器設(shè)備60
• 2 方法60-63
• 2.1 PBP2x_7HC熒光光譜的測(cè)定60
• 2.2 PBP2x_7HC與氨芐西林結(jié)合前后熒光光譜的測(cè)定60-61
• 2.3 PBP2x_7HC激發(fā)波長(zhǎng)的確定61
• 2.4 基于PBP2x_7HC的熒光檢測(cè)法的建立61-62
• 2.5 牛奶樣本的前處理62-63
• 2.6 牛奶樣品添加與回收63
• 2.7 基于PBP2X-7HC的多殘留檢測(cè)方法的建立63
• 2.8 實(shí)際牛奶樣本的檢測(cè)63
• 3 結(jié)果63-73
• 3.1 PBP2x_7HC的激發(fā)光譜及發(fā)射光譜63-64
• 3.2 PBP2x_7HC與氨芐西林結(jié)合前后激發(fā)光譜的變化和選擇64
• 3.3 檢測(cè)方法激發(fā)波長(zhǎng)的確定64-67
• 3.4 基于PBP2x_7HC的β_內(nèi)酰胺類抗生素?zé)晒鈾z測(cè)法67-71
• 3.5 牛奶樣本前處理71
• 3.6 牛奶樣本的添加回收率71-73
• 3.7 多殘留樣本的檢測(cè)73
• 3.8 實(shí)際牛奶樣本的檢測(cè)73
• 4 分析與討論73-76
• 4.1 基于PBP2X_7HC的檢測(cè)方法的建立74-75
• 4.2 牛奶中多種β_內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測(cè)75
• 4.3 遺傳編碼熒光非天然氨基酸用于熒光檢測(cè)75-76
• 5 小結(jié)76-77
• 第四章 提高PBP2x_7HC產(chǎn)率的研究77-94
• 1 實(shí)驗(yàn)材料77-80
• 1.1 試劑77-78
• 1.2 溶液系統(tǒng)78-79
• 1.3 菌株79
• 1.4 儀器設(shè)備79-80
• 2 方法80-83
• 2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建80-81
• 2.2 表達(dá)宿主生長(zhǎng)速度的測(cè)試81
• 2.3 琥珀抑制子壓力下外源目的基因的表達(dá)測(cè)試81-82
• 2.4 UaaTech相關(guān)基因的完整性測(cè)試82
• 2.5 突變基因的分析82
• 2.6 宿主差異蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜定量分析(iTRAQ)82-83
• 2.7 宿主內(nèi)源性蛋白YdiI的調(diào)控及其對(duì)外源目的基因表達(dá)的影響分析83
• 2.8 宿主內(nèi)源性蛋白YdiI的功能分析83
• 3 結(jié)果83-91
• 3.1 質(zhì)粒的構(gòu)建83-86
• 3.2 宿主生長(zhǎng)速度的變化及外源目的基因表達(dá)的改變86-87
• 3.3 UaaTech相關(guān)基因的突變及分析87-88
• 3.4 宿主內(nèi)源性蛋白表達(dá)水平的變化及分析88-89
• 3.5 宿主內(nèi)源性蛋白YdiI的調(diào)控及其對(duì)外源目的基因表達(dá)的影響89-90
• 3.6 宿主內(nèi)源性蛋白YdiI的功能分析90-91
• 4 分析與討論91-93
• 4.1 表達(dá)宿主的表型變化92
• 4.2 表達(dá)宿主外源基因的變化92
• 4.3 表達(dá)宿主內(nèi)源基因的變化92-93
• 4.4 YdiI基因調(diào)控嘗試及功能確定93
• 5 小結(jié)93-94
• 第五章 結(jié)論94-95
• 創(chuàng)新點(diǎn)95-96
• 參考文獻(xiàn)96-105
• 致謝105-106
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷106

  本文關(guān)鍵詞：基于遺傳編碼非天然氨基酸技術(shù)的β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留檢測(cè)方法的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：356064