枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）為原產(chǎn)于我國(guó)的薔薇科枇杷屬植物,根據(jù)果肉顏色可分為紅肉枇杷和白肉枇杷。紅肉枇杷‘洛陽(yáng)青’采后0℃冷藏易發(fā)生冷害,出現(xiàn)冷害木質(zhì)化現(xiàn)象,表現(xiàn)為果肉粗糙少汁、果實(shí)硬度升高和木質(zhì)素積累等,影響果實(shí)商品品質(zhì)。前期研究表明熱激（HT）和程序性降溫（LTC）等處理均可減緩采后冷害木質(zhì)化,改善果實(shí)品質(zhì)。本文以紅肉枇杷‘洛陽(yáng)青’為研究材料,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR、酵母單雜、雙分子熒光互補(bǔ)和雙熒光素酶分析等技術(shù)手段,探究HT和LTC減緩冷害木質(zhì)化的調(diào)控新途徑。主要結(jié)果如下:1、EjCAD5為響應(yīng)HT處理減緩果實(shí)冷害木質(zhì)化的CAD基因家族成員。0℃低溫處理誘導(dǎo)枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化,伴隨有肉桂醇脫氫酶（CAD）活性升高,HT處理可抑制CAD活性的升高;利用枇杷轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分離克隆得到4個(gè)新的CAD基因家族成員,其中EjCAD3和EjCAD5的表達(dá)受0℃誘導(dǎo)上調(diào)和HT抑制,體外功能驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)EjCAD5對(duì)木質(zhì)素單體合成前體物松柏醛、芥子醛和香豆醛具有較高的催化能力,EjCAD3整體催化能力較弱。2、EjHAT1為響應(yīng)HT處理減緩枇杷果實(shí)冷害木質(zhì)化的轉(zhuǎn)錄因子。... 

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木質(zhì)素單體生物合成途徑示意圖（Bonawitz等，2010）

浙江大學(xué)博士論文（2019）1緒論6因擬南芥中木質(zhì)素合成基因4CL1、HCT、COM以及CCR1表達(dá)下調(diào)（Yan等，2013）。對(duì)bHLH轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究，有助于豐富bHLH基因家族功能、完善木質(zhì)素生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。1.3.2HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子1.3.2.1HD-ZIP的結(jié)構(gòu)HD-ZIP是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)DNA結(jié)合特異性、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域可以分為四個(gè)亞家族。HD-ZIP蛋白包含一個(gè)保守的HD結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈（LZ）。HD結(jié)構(gòu)域?qū)︕D(zhuǎn)錄因子識(shí)別結(jié)合靶基因啟動(dòng)子具有重要作用，該結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)與其他蛋白形成同源或異源二聚體并與DNA結(jié)合。如圖1.3所示，第一亞家族HD-ZIP蛋白識(shí)別CAAT(A/T)ATTG的雙重回文DNA序列結(jié)合。基因結(jié)構(gòu)非常的保守，HD結(jié)構(gòu)域在不同蛋白間高度保守，但是LZ結(jié)構(gòu)域差別相對(duì)較大，HD-LZ結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)內(nèi)部包含一個(gè)內(nèi)含子插入。第二亞家族與第一亞家族序列同源性較高，識(shí)別CAAT(G/C)ATTG的對(duì)稱DNA序列結(jié)合（Belamkar等，2014）。與第一類HD-ZIP蛋白不同，除了比較保守的HD和LZ結(jié)構(gòu)域外，還包含一個(gè)保守的半胱氨酸-脯氨酸-絲氨酸-半胱氨酸-谷氨酸（CPSCE）結(jié)構(gòu)域，HD-LZ結(jié)構(gòu)域內(nèi)包含兩個(gè)內(nèi)含子插入。第三亞家族的HD-ZIP蛋白與前兩個(gè)亞家族具有較大的差異，識(shí)別DNA序列為GTAAT(G/C)ATTAC，HD-LZ結(jié)構(gòu)域位于N端，還含有一個(gè)脂質(zhì)調(diào)節(jié)蛋白（START）結(jié)構(gòu)域、SAD（STARTadjacentdomain）結(jié)構(gòu)域以及位于C端高度保守的MEKHLA結(jié)構(gòu)域。第四亞家族HD-ZIP與第三亞家族結(jié)構(gòu)組成上基本相同，但是缺失MEKHLA結(jié)構(gòu)域，識(shí)別DNA序列CAAT(A/T)AATG進(jìn)行特異性結(jié)合（Ariel等，2007）。圖1.3HD-ZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)（Ariel等，2007）Fig1.3thestructureofHD-ZIPtranscriptionfactors

浙江大學(xué)博士論文（2019）2EjHAT1抑制EjCAD5參與冷害木質(zhì)化17圖2.1枇杷果肉木質(zhì)素的分布和組分（A）枇杷果肉木質(zhì)素在宏觀和放大區(qū)域分布。（B）硝基苯氧化方法測(cè)定枇杷果肉木質(zhì)素組分。G型單體為香草醛（G1）和香草酸（G2）總和，S型單體為紫丁香醛（S1）和丁香酸（S2）總和，H型單體為對(duì)羥基苯甲醛（H1）和對(duì)羥基苯甲酸（H2）總和。Fig.2.1Lignindistributionandcompositionofloquatflesh(A)LignindistributioninLYQloquatatthemacroscopic-scaleandenlargedviewsoftheregionsinthesquareboxesoffruitfleshstained.(B)Thephotographofloquatfleshlignincompositionusingthenitrobenzeneoxidationmethod.Thesumofvanillin(G1)andvanillicacid(G2)fortotalGmonomer.Thesumofsyringaldehyde(S1)andsyringicacid(S2)fortotalSmonomer.Thesumofp-hydroxybenzaldehyde(H1)andp-hydroxybenzoicacid(H2)fortotalHmonomer.2.2.20℃和HT處理對(duì)CAD酶活性的影響如圖2.2所示，0℃處理枇杷果肉CAD粗酶活在1d升高，2d-4d開始緩慢下降，然后保持相對(duì)穩(wěn)定。HT處理的枇杷果實(shí)在前2d保持相對(duì)穩(wěn)定，2d-4d下降，6d-8d呈微弱升高，HT處理的CAD酶活性變化相對(duì)穩(wěn)定。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道的數(shù)據(jù)（Xu等，2014），0℃和HT處理的CAD酶活性變化趨勢(shì)與木質(zhì)素的變化呈正相關(guān)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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