本文關(guān)鍵詞：魚類TRIM基因系統(tǒng)進(jìn)化分析及免疫功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：TRIM蛋白是以N端三重基序(Ring鋅指結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或兩個(gè)B-Boxes結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Coiled-coil結(jié)構(gòu)域)為特征而C端含有不同類型結(jié)構(gòu)域的一類蛋白的統(tǒng)稱,因此TRIM蛋白又被稱為RBCC蛋白。TRIM蛋白是一個(gè)古老的蛋白家族,存在于所有多細(xì)胞動(dòng)物中,但每個(gè)物種中的數(shù)量不盡相同,并隨著脊椎動(dòng)物的進(jìn)化而快速擴(kuò)張形成龐大的蛋白家族。TRIM蛋白保守的結(jié)構(gòu)域組成也預(yù)示其在細(xì)胞生命活動(dòng)中具有共同的生化功能。研究顯示TRIM蛋白作為一類E3泛素連接酶參與了細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和先天性免疫信號(hào)通路等生命過程。相對(duì)于人源TRIM基因豐富的研究成果,魚類來源的TRIM基因則鮮有報(bào)道。本研究針對(duì)魚類來源的TRIM基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析及多樣性研究,探討魚類TRIM基因的進(jìn)化方向和多樣性,并以嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染的斑馬魚(Danio rerio)為模型研究魚類TRIM基因在細(xì)菌侵染過程中對(duì)固有免疫信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。本研究系統(tǒng)分析斑馬魚基因組中所有198個(gè)TRIM基因,包括染色體定位、剪接體個(gè)數(shù)和結(jié)構(gòu)域組成等,首次發(fā)現(xiàn)四個(gè)C端不同結(jié)構(gòu)域的TRIM蛋白,這在其它物種中還沒有報(bào)道過。另外,首次對(duì)軟骨魚象鼻鯊(Callorhinchus milii)基因組通過Blast比對(duì)分析,共發(fā)現(xiàn)57條TRIM基因序列。通過對(duì)斑馬魚、象鼻鯊和人類部分TRIM蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,發(fā)現(xiàn)在斑馬魚和象鼻鯊中分別有3個(gè)(ftr、btr和trim35)和1個(gè)(zinc binding A33 like protein)基因亞家族,每個(gè)亞家族均含有多個(gè)基因成員,且與人類TRIM基因沒有同源性,表明軟骨魚、硬骨魚和人類的TRIM基因有著不同的進(jìn)化方向,且魚類基因多樣性更加豐富。通過基因同線性分析結(jié)果表明,斑馬魚TRIM基因在進(jìn)化中經(jīng)歷了適應(yīng)性進(jìn)化和快速擴(kuò)張,并發(fā)生基因復(fù)制、分化和缺失等遺傳事件,形成龐大的TRIM基因家族。結(jié)果表明魚類TRIM基因受環(huán)境壓力選擇明顯,進(jìn)化更加迅速,基因多樣性更加豐富,并且在免疫系統(tǒng)中扮演重要作用。首次從軟骨魚條紋斑竹鯊(Chiloscyllium plagiosum)中克隆得到兩個(gè)TRIM基因Cptrim35和Cptrim39,基因全長(zhǎng)分別為1,935 bp和1,829 bp,分別編碼537和488個(gè)氨基酸。Cptrim35基因具有三種不同的剪接體。結(jié)構(gòu)域分析表明兩個(gè)TRIM蛋白的C端都是B30.2結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明這兩個(gè)TRIM蛋白與硬骨魚來源的同源TRIM蛋白處于同一進(jìn)化分支中,但比硬骨魚TRIM蛋白更古老。通過定量PCR技術(shù)檢測(cè)了Cptrim35和Cptrim39基因在條紋斑竹鯊各組織分布情況和攻毒后差異表達(dá)分析。通過分析Cptrim35和Cptrim39蛋白在細(xì)胞中的定位以及Ring結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶活性,表明條紋斑竹鯊來源的Cptrim35和Cptrim39作為一類依賴Ring結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶在機(jī)體抵抗病原微生物的過程中發(fā)揮重要作用。以嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)侵染斑馬魚為模型,首次分析了斑馬魚TRIM基因在細(xì)菌侵染過程中的差異表達(dá)情況,篩選獲得部分差異表達(dá)顯著的TRIM基因,包括trim1、trim16、trim19、trim23、btr20、btr24、trim35-21、trim35-28、ftr24和ftr43等。利用RT-q PCR技術(shù)和RNAi技術(shù)進(jìn)一步分析了btr20基因在整個(gè)侵染過程中的表達(dá)變化以及與NF-κB基因的相互表達(dá)關(guān)系,證明斑馬魚btr20基因在先天性免疫信號(hào)通路中起到重要調(diào)節(jié)作用。為進(jìn)一步了解斑馬魚TRIM蛋白在免疫信號(hào)通路中的調(diào)節(jié)作用,利用酵母雙雜交技術(shù)在斑馬魚脾臟c DNA雜交文庫(kù)中對(duì)trim1和trim23蛋白進(jìn)行互作蛋白的篩選,得到一些與免疫信號(hào)通路相關(guān)的互作蛋白,其中trim1的互作蛋白有sestrin,trim23的互作蛋白有Uba52、Ubc E2I、lectin和cp-2。trim23和Ubc E2I的體外互作實(shí)驗(yàn)證明兩個(gè)蛋白具有互作關(guān)系。綜上所述,本研究通過對(duì)魚類TRIM基因系統(tǒng)進(jìn)化分析和細(xì)菌侵染過程中的差異表達(dá)分析,表明魚類TRIM基因受環(huán)境壓力選擇明顯,進(jìn)化更加迅速,編碼的蛋白質(zhì)作為E3泛素連接酶在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。篩選得到部分互作的信號(hào)通路蛋白,為進(jìn)一步了解TRIM蛋白對(duì)免疫信號(hào)通路的調(diào)節(jié)機(jī)理提供了必要的材料。
【關(guān)鍵詞】：TRIM 斑馬魚 軟骨魚 系統(tǒng)進(jìn)化分析 細(xì)菌侵染 互作蛋白
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S917.4
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-18
• 英文縮略表18-19
• 第一章 緒論19-34
• 1.1 TRIM蛋白19-30
• 1.1.1 TRIM蛋白各結(jié)構(gòu)域特征及功能19-24
• 1.1.2 泛素化系統(tǒng)24-26
• 1.1.3 TRIM蛋白在免疫系統(tǒng)中的功能26-28
• 1.1.4 TRIM蛋白表達(dá)特征28-30
• 1.2 TRIM蛋白的分類及進(jìn)化30-32
• 1.2.1 TRIM蛋白的分類30-31
• 1.2.2 TRIM蛋白的進(jìn)化31-32
• 1.3 魚類TRIM基因研究現(xiàn)狀32-33
• 1.4 本研究的目的及意義33-34
• 第二章 魚類TRIM基因系統(tǒng)進(jìn)化分析34-50
• 第一節(jié) 斑馬魚TRIM基因多樣性分析34-45
• 1.1 斑馬魚TRIM基因序列及蛋白質(zhì)序列資源的獲得34
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法34
• 1.2.1 斑馬魚TRIM蛋白分類34
• 1.2.2 斑馬魚TRIM基因在染色體上定位及同線性分析34
• 1.2.3 斑馬魚TRIM基因序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)生分析34
• 1.3 結(jié)果與分析34-41
• 1.3.1 斑馬魚TRIM蛋白分類34-36
• 1.3.2 斑馬魚TRIM基因在染色體上的定位及同線性分析36-39
• 1.3.3 RBCC-B30.2 TRIM蛋白系統(tǒng)發(fā)生分析39-41
• 1.4 討論41-43
• 1.5 小結(jié)43-45
• 第二節(jié) 魚類TRIM基因系統(tǒng)進(jìn)化分析45-50
• 2.1 序列資源45
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法45
• 2.2.1 象鼻鯊TRIM蛋白分類45
• 2.2.2 魚類TRIM基因序列比對(duì)、同線性分析和系統(tǒng)發(fā)生分析45
• 2.3 結(jié)果與分析45-48
• 2.3.1 象鼻鯊TRIM蛋白分類45-46
• 2.3.2 魚類TRIM蛋白系統(tǒng)發(fā)生分析46-48
• 2.4 討論48
• 2.5 小結(jié)48-50
• 第三章 條紋斑竹鯊TRIM基因克隆及免疫功能研究50-84
• 第一節(jié) 條紋斑竹鯊TRIM基因克隆及進(jìn)化分析50-65
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 1.1.1 材料50
• 1.1.2 菌株、質(zhì)粒與引物50
• 1.1.3 試劑與工具酶50
• 1.1.4 溶液和培養(yǎng)基50
• 1.1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器及材料50-51
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法51-57
• 1.2.1 條紋斑竹鯊脾臟組織總RNA的提取51
• 1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得第一鏈cDNA51-52
• 1.2.3 TRIM基因簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)52
• 1.2.4 條紋斑竹鯊TRIM基因保守區(qū)片段的克隆52-54
• 1.2.5 條紋斑竹鯊TRIM基因全長(zhǎng)序列的獲得54-56
• 1.2.6 條紋斑竹鯊TRIM基因進(jìn)化分析56-57
• 1.3 結(jié)果與分析57-64
• 1.3.1 TRIM基因簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)57
• 1.3.2 條紋斑竹鯊TRIM基因保守區(qū)片段的擴(kuò)增57-58
• 1.3.3 Cptrim35和Cptrim39全長(zhǎng)基因的獲得58
• 1.3.4 序列比對(duì)及進(jìn)化分析58-64
• 1.4 討論64
• 1.5 小結(jié)64-65
• 第二節(jié) 條紋斑竹鯊Cptrim35基因功能研究65-76
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料65-66
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚、菌株、細(xì)胞、質(zhì)粒與載體65
• 2.1.2 引物65
• 2.1.3 試劑與工具酶65-66
• 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器66
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法66-72
• 2.2.1 條紋斑竹鯊Cptrim35基因組織分布及攻毒后差異表達(dá)分析66-67
• 2.2.2 條紋斑竹鯊Cptrim35亞細(xì)胞定位的研究67-70
• 2.2.3 Cptrim35、Ring缺失體及其剪接體的體外泛素化檢測(cè)70-72
• 2.3 結(jié)果與分析72-75
• 2.3.1 條紋斑竹鯊Cptrim35基因各組織分布分析72
• 2.3.2 LPS和poly I:C攻毒后表達(dá)差異分析72-73
• 2.3.3 Cptrim35及其剪接體在HEK293T細(xì)胞中的定位73-74
• 2.3.4 Cptrim35及其剪接體的體外自我泛素化活性檢測(cè)74-75
• 2.4 討論75-76
• 第三節(jié) 條紋斑竹鯊Cptrim39基因功能研究76-84
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料76
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚、菌株、細(xì)胞、質(zhì)粒與載體76
• 3.1.2 引物76
• 3.1.3 主要試劑與工具酶76
• 3.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器76
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法76-79
• 3.2.1 條紋斑竹鯊Cptrim39基因組織分布及攻毒后差異表達(dá)分析76-77
• 3.2.2 條紋斑竹鯊Cptrim39亞細(xì)胞定位的研究77-78
• 3.2.3 Cptrim39及Ring缺失體的體外泛素化檢測(cè)78
• 3.2.4 數(shù)據(jù)處理78-79
• 3.3 結(jié)果與分析79-82
• 3.3.1 條紋斑竹鯊Cptrim39基因組織分布分析79-80
• 3.3.2 Cptrim39基因NJ-1 攻毒后表達(dá)差異分析80-81
• 3.3.3 Cptrim39亞細(xì)胞定位81-82
• 3.3.4 Cptrim39體外自我泛素化活性檢測(cè)82
• 3.4 討論82-83
• 3.5 小結(jié)83-84
• 第四章 TRIM基因在嗜水氣單胞菌侵染斑馬魚模型中功能研究84-107
• 第一節(jié) 嗜水氣單胞菌侵染斑馬魚模型的建立84-87
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料84-85
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚及菌株84
• 1.1.2 引物84
• 1.1.3 主要試劑84
• 1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器84-85
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法85
• 1.2.1 嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）NJ-1 感染斑馬魚85
• 1.2.2 斑馬魚相關(guān)免疫因子檢測(cè)85
• 1.3 結(jié)果與分析85-86
• 1.3.1 攻毒菌體濃度及攻毒時(shí)間的確定85-86
• 1.3.2 RT-qPCR檢測(cè)攻毒后免疫因子變化86
• 1.4 討論86-87
• 第二節(jié)TRIM基因差異表達(dá)的篩選87-91
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料87
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚及菌株87
• 2.1.2 引物87
• 2.1.3 主要試劑87
• 2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器87
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法87
• 2.2.1 RT-qPCR引物驗(yàn)證87
• 2.2.2 攻毒后斑馬魚TRIM基因表達(dá)水平檢測(cè)87
• 2.2.3 數(shù)據(jù)處理87
• 2.3 結(jié)果與分析87-90
• 2.3.1 斑馬魚泛素化系統(tǒng)中相關(guān)基因差異表達(dá)分析87-88
• 2.3.2 斑馬魚TRIM基因差異表達(dá)分析88-90
• 2.4 討論90-91
• 第三節(jié)btr20基因功能研究91-99
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料91
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚、菌株、細(xì)胞、質(zhì)粒與載體91
• 3.1.2 引物91
• 3.1.3 主要試劑與工具酶91
• 3.1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器91
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法91-94
• 3.2.1 斑馬魚btr20基因組織分布及攻毒后差異表達(dá)分析91-92
• 3.2.2 btr20亞細(xì)胞定位的研究92
• 3.2.3 btr20體外泛素化檢測(cè)92-93
• 3.2.4 btr20基因在ZF4細(xì)胞中的敲除實(shí)驗(yàn)93-94
• 3.2.5 數(shù)據(jù)處理94
• 3.3 結(jié)果與分析94-98
• 3.3.1 btr20基因組織分布及攻毒后差異表達(dá)檢測(cè)94-96
• 3.3.2 btr20亞細(xì)胞定位96-97
• 3.3.3 btr20體外與不同泛素結(jié)合酶E2的自我泛素化活性檢測(cè)97
• 3.3.4 btr20在ZF4細(xì)胞中敲除后引起NF-κB下調(diào)表達(dá)97-98
• 3.4 討論98-99
• 第四節(jié) 斑馬魚TRIM蛋白互作蛋白的篩選及驗(yàn)證99-107
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料99
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)用魚99
• 4.1.2 菌株和質(zhì)粒99
• 4.1.3 試劑和工具酶99
• 4.1.4 試劑和培養(yǎng)基的配制99
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法99-102
• 4.2.1 TRIM-pGBKT7融合載體的構(gòu)建99-100
• 4.2.2 誘餌蛋白的自激活檢測(cè)100
• 4.2.3 誘餌蛋白對(duì)宿主細(xì)胞毒性的檢測(cè)100
• 4.2.4 斑馬魚脾臟組織Y2H cDNA文庫(kù)的建立100-101
• 4.2.5 誘餌菌株和文庫(kù)宿主菌的雙雜交101
• 4.2.6 表達(dá)相互作用蛋白酵母二倍體的篩選101
• 4.2.7 計(jì)算融合效率和可篩選的克隆數(shù)101
• 4.2.8 分析陽性相互作用101
• 4.2.9 候選蛋白的pull-down驗(yàn)證101-102
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果102-105
• 4.3.1 TRIM蛋白誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建102-103
• 4.3.2 TRIM誘餌蛋白自激活檢測(cè)103
• 4.3.3 TRIM誘餌蛋白對(duì)酵母宿主細(xì)胞的毒性檢測(cè)103
• 4.3.4 斑馬魚脾臟cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及質(zhì)量鑒定103-104
• 4.3.5 trim1和trim23誘餌蛋白與cDNA文庫(kù)的雜交篩選互作蛋白104
• 4.3.6 trim23蛋白與UbcE2I蛋白的pull-down驗(yàn)證104-105
• 4.4 討論105-106
• 4.5 本章小結(jié)106-107
• 第五章 全文結(jié)論與展望107-108
• 參考文獻(xiàn)108-118
• 附錄118-131
• 致謝131-132
• 作者簡(jiǎn)歷132

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 張新尚;魚類TRIM基因系統(tǒng)進(jìn)化分析及免疫功能研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

  本文關(guān)鍵詞：魚類TRIM基因系統(tǒng)進(jìn)化分析及免疫功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：342408