本文關鍵詞：對比研究狂犬病病毒BD06及SRV9株對宿主細胞干擾素通路的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：狂犬病至今依然是一種嚴重的公共健康威脅,尤其是在發(fā)展中國家和地區(qū)。我國每年因狂犬病死亡的人數(shù)超過2000,然而狂犬病的發(fā)病機制至今依然不清楚,也缺乏有效的治療手段,使得其病死率接近100%�？袢〉牟≡饕强袢〔《�(RABV),RABV病毒粒子由5種結構蛋白(核蛋白、磷蛋白、基質蛋白、糖蛋白和大蛋白)及負鏈基因組RNA組成。為了弄清RABV的致病機制,近年來學者們一直致力于研究RABV病毒粒子各組分與宿主各種生物學過程之間的相互作用,如RABV結構蛋白對宿主固有免疫的影響等,希望能借類似的研究找到治療狂犬病的手段�？上驳氖�,最近對RABV的研究取得了很大的進展,比如科學家發(fā)現(xiàn)RABV磷蛋白可以抑制宿主的干擾素通路,通過改變磷蛋白的這種能力可以影響病毒的毒力;又比如日本科學家發(fā)現(xiàn)RABV核蛋白也可以影響干擾素的激活,通過改變核蛋白的氨基酸組成可以減弱病毒的毒力。然而,依然有很多問題需要我們去解決,例如RABV的干擾素抑制能力與病毒毒力是否存在某種必然聯(lián)系;RABV磷蛋白及核蛋白均可以影響干擾素的激活,那么其它蛋白是否也具有這種能力;RABV對干擾素的抑制能力在病毒感染過程中扮演一個什么角色,這些問題都還不清楚。鑒于此,我們設計實驗開展了本課題。我們選擇了一株在世界范圍內大規(guī)模應用于疫苗生產(chǎn)的RABV弱毒株SRV9和一株在中國廣泛流行的強毒株BD06,利用對比研究的方法分析了它們在體內以及體外感染造成的基因表達差異,同時分析了兩株病毒結構蛋白的干擾素拮抗能力,以弄清兩株病毒結構蛋白干擾素拮抗能力與病毒毒力之間的關系。具體研究過程如下:我們首先篩選條件獲取了在細胞上培養(yǎng)的較高滴度的BD06,并對其進行了鑒定,確定沒有發(fā)生關鍵性突變,且毒力沒有減弱;然后我們利用腦內攻毒的方法,將相同毒量104ffu(30μl)的強毒BD06和弱毒SRV9以及培養(yǎng)基對照接種Balb/c小鼠,觀察兩株病毒感染的過程,結果發(fā)現(xiàn)SRV9完全不致病,只是在感染的初期造成了感染病毒小鼠體重的下降,而感染BD06的小鼠在第5天全部發(fā)病,并在第6天到第7天全部死亡;鑒于兩種病毒完全不一致的感染結果,而小鼠大腦對病毒的抵抗尤其是早期主要依賴于固有免疫,對RABV來說,宿主的固有免疫主要以干擾素相關反應為核心,因此我們分析了小鼠感染兩株RABV的干擾素反應。分別將感染兩株病毒后第2天、第4天和第6天的小鼠取腦組織提取RNA,利用定量PCR的方法分析了干擾素β(IFNβ)及其誘導的抗病毒反應相關蛋白OAS-1G和Mx1的表達。結果發(fā)現(xiàn)SRV9在感染后第2天即可激活較高水平的干擾素反應,并在第4天達到峰值,而在第6天出現(xiàn)明顯的回落;但是BD06感染的小鼠在第2天表現(xiàn)出一個相對較弱的干擾素反應,在第4天明顯升高,而在第6天小鼠發(fā)病瀕死時仍持續(xù)升高。二者的干擾素反應動力學差別很大,BD06感染誘導的干擾素反應早期較弱而晚期較強與SRV9構成顯著差別。我們接下來對比了兩株RABV感染293細胞后,細胞基因表達譜的變化。利用Ion proton平臺對RABV感染的293AD細胞轉錄組進行測序。每個樣品共獲得了約1200萬個reads,比對到參考基因和參考基因組之后,都能夠獲得大于80%的比對率,說明測序結果可靠。對所有讀數(shù)比對到參考基因后利用RPKM對基因的表達進行了歸一化,并對BD06和SRV9相對于對照以及BD06相對于SRV9的基因表達變化進行了定量分析,分別找到了2317(SRV9相對于對照),3331(BD06相對于對照)和2760(BD06相對于SRV9)個差異表達的基因。對這些差異表達的基因進行聚類分析,發(fā)現(xiàn)根據(jù)GO分類進行的聚類中,SRV9及BD06相對于對照發(fā)生改變的基因并沒有明顯的底層條目聚集,而當我們將BD06對SRV9的表達差異進行聚類分析時,發(fā)現(xiàn)差異表達的基因在細胞因子這一條目聚集。對差異表達的基因基于KEGG注釋做了通路分析,結果發(fā)現(xiàn)BD06造成的表達差異向病毒感染相關通路聚集,而SRV9的感染的差異基因富集不明顯。說明在感染的早期,BD06與細胞的相互作用相對于SRV9更加激烈�？紤]到RABV結構蛋白對固有免疫有拮抗作用,我們接著分別對比了BD06及SRV9對干擾素通路抑制能力的差別。利用RIG-I蛋白N端的CARDs結構域可以激活類似于RABV激活的固有免疫反應,所以為了排除非相關成分對實驗結果的干擾,我們沒有選擇用RABV或者諸如VSV之類的病毒來激活細胞的固有免疫,而是選擇直接轉染表達人RIG-I-CARDs的真核載體以激活細胞的固有免疫,主要是RIG-I依賴的IFNβ相關通路。然后我們分別轉染表達載體對照及SRV9或BD06核蛋白、磷蛋白、基質蛋白或糖蛋白的真核質粒,在細胞同時過表達RIG-I-CARDs以及RABV結構蛋白,用免疫印跡檢測這些基因在細胞中的過表達后,用定量PCR的方法檢測細胞的干擾素反應,包括檢測IFNβ以及IFNβ誘導基因PKR和OAS的表達水平以對比分析RABV結構蛋白對干擾素激活的抑制能力。結果發(fā)現(xiàn)RABV磷蛋白表現(xiàn)出主要的對IFNβ激活的抑制能力,且磷蛋白的對干擾素通路的抑制能力要在SRV9和BD06之間存在顯著差異。盡管有報道表明RABV核蛋白對干擾素通路激活也存在抑制能力,但是我們表達核蛋白時,發(fā)現(xiàn)核蛋白對RIG-I激活的抑制作用不顯著。另外盡管與RABV類似的彈狀病毒VSV基質蛋白對干擾素激活有抑制能力,但是RABV的基質蛋白并沒有表現(xiàn)出這種能力,同時糖蛋白也不能拮抗干擾素的激活過程。由以上研究,可以得出結論如下:狂犬病病毒弱毒SRV9株能在感染小鼠大腦后迅速誘導固有免疫反應,并在感染中期達到峰值,但是會在感染后期回落;而強毒株BD06株則在感染早期產(chǎn)生相對較弱的干擾素反應,但是會隨著感染持續(xù)加強。兩株病毒的干擾素反應動力學存在顯著差異,且單純的干擾素反應并不足以清除病毒,保護動物免受死亡�？袢〔《救醵局闟RV9株誘導細胞基因表達的變化是普遍的,但是富集程度不高,BD06相對于SRV9發(fā)生的基因表達變化在功能上向細胞因子這一分類富集,在通路上向抗病毒反應相關通路富集。BD06在感染誘導更明顯的固有免疫反應�？袢〔《玖椎鞍妆憩F(xiàn)出主要的干擾素拮抗活性,核蛋白對干擾素通路的影響是間接的,而糖蛋白基質蛋白不具備這種能力。BD06株磷蛋白的干擾素拮抗能力弱于SRV9磷蛋白,而兩株病毒核蛋白的干擾素通路抑制能力無差別。強毒BD06株狂犬病病毒對干擾素激活的抑制能力弱于SRV9株�？袢〔《窘Y構蛋白對干擾素的拮抗能力與病毒毒力之間缺乏正相關性。
【關鍵詞】：狂犬病病毒 結構蛋白 毒力 固有免疫 干擾素拮抗
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.655
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一章 RABV感染引起的小鼠腦內固有免疫反應對比研究14-27
• 1.1 材料與方法14-18
• 1.2 實驗結果18-24
• 1.2.1 兩株病毒在BHK-21細胞上的最高穩(wěn)定滴度18-19
• 1.2.2 兩株病毒在Balb/c上小鼠的毒力對比19-20
• 1.2.3 兩株病毒引起的小鼠干擾素相關反應動力學對比20-24
• 1.3 討論24-26
• 1.4 小結26-27
• 第二章 兩株病毒感染 293AD細胞的表達譜對比分析27-41
• 2.1 實驗方法27-30
• 2.2 差異表達基因的基因功能聚類分析30-33
• 2.3 差異表達基因的通路分析33-39
• 2.4 討論39-40
• 2.5 小結40-41
• 第三章 兩株病毒結構蛋白對IFNΒ 通路的拮抗能力對比分析41-52
• 3.1 材料與方法41-46
• 3.2 結果46-50
• 3.2.1 質粒構建與鑒定46
• 3.2.2 兩株RABV磷蛋白對干擾素通路的影響46-47
• 3.2.3 兩株RABV核蛋白對干擾素通路的影響47-48
• 3.2.4 兩株RABV基質蛋白對干擾素通路的影響48-49
• 3.2.5 兩株RABV糖蛋白對干擾素通路的影響49-50
• 3.3 討論50-51
• 3.4 小結51-52
• 結論52
• 創(chuàng)新點52-53
• 參考文獻53-57
• 文獻綜述57-84
• 參考文獻75-84
• 個人簡介84-85
• 致謝8

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本文編號：339648