胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）的致病菌,該病原能引起豬的纖維素性胸膜炎和出血性肺炎,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究證明胸膜肺炎放線桿菌具有多種毒力因子,包括Apx分泌外毒素、脂多糖、莢膜多糖等。這些毒力因子都是體外培養(yǎng)條件下表達(dá)的,對(duì)APP體內(nèi)誘導(dǎo)抗原的研究并不多。體內(nèi)誘導(dǎo)抗原是病原菌在感染過(guò)程中特異表達(dá)的抗原,這些抗原在致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。鑒定胸膜肺炎防線桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)抗原,有利于進(jìn)一步揭示其感染的機(jī)制。本研究運(yùn)用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)篩選到APP的體內(nèi)誘導(dǎo)抗原,證明這些抗原在感染過(guò)程中優(yōu)先表達(dá)。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證明APP體內(nèi)誘導(dǎo)抗原半乳糖代謝相關(guān)酶（GalT）能誘導(dǎo)有效的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答,是良好的免疫原。研究證明GalT刺激巨噬細(xì)胞能促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子的分泌,同時(shí)揭示了此過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。具體工作如下:1、APP體內(nèi)誘導(dǎo)抗原GalT的鑒定及轉(zhuǎn)錄分析本研究使用運(yùn)用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)（IVIAT）鑒定了APP感染過(guò)程中體... 

【文章來(lái)源】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)四川省 211工程院校

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運(yùn)用qRT-PCR分析體內(nèi)誘導(dǎo)抗原體內(nèi)外表達(dá)水平差異

圖 2.1 利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)活體誘導(dǎo)抗原的抗原特性Fig 2.1Antigenic properties of the in vivo-induced antigens predicted using a bioinformatics approach.1.6 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原重組表達(dá)菌株的構(gòu)建從 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因并保存。使用 Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)克隆這些基因序列的引物。這些體內(nèi)誘導(dǎo)抗原基因序列的引物的具體內(nèi)容，包括序列和產(chǎn)物等內(nèi)容見(jiàn)表 2.1。在這些引物序列中，帶有下劃線的核苷酸序列代表添加的限制性酶切位點(diǎn)。于 TSB 中 37℃過(guò)夜培養(yǎng) APP L20 菌株，使用基因組提取試劑盒抽提 APP 基因組 DNA。以抽提的基因組 DNA 為模板，用 PCR 方法擴(kuò)增六個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)抗原的基因。使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增序列和 pET-28a 進(jìn)行酶切。用 T4 DNA連接酶連接擴(kuò)增序列片段和暴露酶切位點(diǎn)的 pET-28a，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。用 PCR 擴(kuò)增和限制性酶切分析方法證明重組子，并對(duì)插入序列進(jìn)行測(cè)序分析。用 BLAST 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步比對(duì)分析。

2 結(jié)果2.1 重組蛋白的表達(dá)與免疫印跡分析PCR 擴(kuò)增表達(dá)重組蛋白菌株的基因序列，測(cè)序和用限制性酶切分析。PCR、測(cè)限制性酶切分析證明，PCR 擴(kuò)增片段和酶切結(jié)果獲得了預(yù)期大小片段，測(cè)序結(jié)明該片段序列與 L20 菌株基因組序列一致。將重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌 BL達(dá)菌株，并成功表達(dá)了組氨酸標(biāo)簽融合蛋白。SDS-PAGE 電泳結(jié)果表明大腸桿菌達(dá)出來(lái)預(yù)期大小的融合蛋白。用鎳離子親和層析方法純化重組融合蛋白，DS-PAGE 電泳分析純化結(jié)果(圖 2.2A)。運(yùn)用重組蛋白抗血清進(jìn)行免疫印跡分析。個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)抗原的 SDS-PAGE 電泳結(jié)果對(duì)比(圖 2.2A)，在免疫印跡結(jié)果上相應(yīng)大置均有相應(yīng)的反應(yīng)條帶(圖 2.2B)。結(jié)果表明，這些蛋白均能與相應(yīng)的抗血清反應(yīng)這些蛋白具有抗原性能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生 IgG。A. B.

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[7]新型基因工程亞單位菌苗對(duì)豬傳染性胸膜肺炎的保護(hù)效力研究[J]. 劉建杰,陳煥春,李沖,何啟蓋,吳斌.  中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué). 2005(03)

碩士論文
[1]豬胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定及其核酸疫苗的初步研究[D]. 彭娟.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2011



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