合浦珠母貝（Pinctada fucata）是研究貝類礦化機(jī)理的研究物種之一,其珍珠層具有優(yōu)良的性能而受到關(guān)注,對于貝殼形成原理的探索是本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。在之前的研究中通過基因芯片測定不同發(fā)育時期各基因轉(zhuǎn)錄水平的高低,結(jié)合基質(zhì)蛋白特征篩選出若干基質(zhì)蛋白候選基因,它們的具體功能還需要深入研究。本研究選取其中的一個unigene進(jìn)行克隆和功能鑒定,命名為mantle protein N25（簡稱N25）,論文首先深入分析了N25蛋白的功能和影響礦化的機(jī)理。通過RACE克隆獲得了N25基因的全長,檢測到該基因在外套膜組織中特異性表達(dá)。本研究使用原核表達(dá)純化難溶性基質(zhì)蛋白N25的包涵體,再利用蛋白質(zhì)重折疊獲得了具有活性的可溶性蛋白,初步建立一種通過包涵體復(fù)性獲得難溶性基質(zhì)蛋白的方案。純化獲得的N25蛋白具有結(jié)合方解石、文石和幾丁質(zhì)的能力。貝殼組分的免疫印跡顯示N25蛋白分布于棱柱層和珍珠層的不可溶性組分。N25蛋白對方解石和文石的結(jié)晶形貌都有明顯的影響,我們使用結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡對Cy5標(biāo)記的N25在方解石上的分布進(jìn)行了成像定位,結(jié)果顯示N25蛋白只分布在晶體表面而不進(jìn)入晶體內(nèi)部。借助軟件計(jì)... 

【文章來源】：清華大學(xué)北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

生物誘導(dǎo)礦化示意圖(Mann,2001)

第1章前言5如圖1.2A，B所示，生物控制礦化一般按照發(fā)生的部位可以分為細(xì)胞內(nèi)礦化和細(xì)胞外礦化兩大方式(Mann,2001)。胞內(nèi)礦化，通常是先形成胞內(nèi)的特定腔室作為礦化發(fā)生場所，細(xì)小的礦物晶體首先在這些細(xì)胞器中形成，進(jìn)而通過囊泡等方式被運(yùn)輸?shù)浇咏?xì)胞膜表面，再由胞吐過程被分泌出去到達(dá)特定的礦化位點(diǎn)發(fā)揮作用。細(xì)胞外礦化則是細(xì)胞將礦化的原料輸出到細(xì)胞外，達(dá)到一定的閾值之后開始發(fā)生生物誘導(dǎo)的化學(xué)沉積礦化，例如基質(zhì)蛋白的分泌誘導(dǎo)了貝殼、骨針等結(jié)構(gòu)的有序沉積礦化。無論是哪一種方式，兩者都受到了嚴(yán)格的調(diào)控。而且兩類過程都需要大量蛋白的直接參與，主要的不同點(diǎn)在于，細(xì)胞外礦化輸送的是礦化的原材料，細(xì)胞內(nèi)則幾乎是預(yù)先形成半成品。圖1.2生物控制礦化過程示意圖(Mann,2001)A：胞外礦化；B：胞內(nèi)礦化。生物控制礦化有兩類主要途徑，分別是胞外礦化和胞內(nèi)礦化。相似的地方是，兩類過程終產(chǎn)物都有胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)，主要區(qū)別是分泌的囊泡中的物質(zhì)是離子還是固定化的離子。胞外礦化中，有機(jī)分子和離子先分泌至胞外，之后有機(jī)大分子調(diào)控?zé)o機(jī)離子沉積形成特定的結(jié)構(gòu)。胞內(nèi)礦化則是在胞內(nèi)的離子先形成體積較小的晶體，然后被運(yùn)輸?shù)桨�，接著受到有機(jī)分子進(jìn)一步調(diào)控形成礦化結(jié)構(gòu)。小晶體的聚合沉積過程往往更加復(fù)雜一些，這一過程涉及到了晶體形貌發(fā)生、結(jié)構(gòu)成型、礦化促進(jìn)與抑制因子的調(diào)節(jié)。此外，晶體的特定方向的生長和沉積受到胞外有機(jī)分子的精密調(diào)控。Excretion，分泌；vesicles，囊泡；organics，有機(jī)質(zhì)；morphgenesis，晶貌；tectonics，構(gòu)造；promotor，促進(jìn)因子；inhibitors，抑制因子；orientedmineralgrowth，固定朝向的生長。

第1章前言10的形態(tài)，進(jìn)而對于珍珠層的正常發(fā)育和沉積起到重要調(diào)控作用(Suzukietal.,2009)。圖1.3Pif蛋白的RNA干擾與文石片層異常沉積(Suzukietal.,2009)針對Pif基因的dsRNA注射對于基因表達(dá)量和貝殼形態(tài)的影響。圖A，注射各種濃度的dsRNA后Pif的基因的相對表達(dá)量，PBS組僅注射PBS緩沖液，GFP組注射相同濃度的針對GFP基因的dsRNA，Pif5、Pif15、Pif30分別是注射5、15、30μg針對Pif基因的dsRNA；B，注射PBS緩沖液的對照組，珍珠層內(nèi)表面的掃描電鏡成像；C，注射30μgPif基因的dsRNA，珍珠層內(nèi)表面的掃描電鏡成像；D，注射PBS緩沖液之后，將對照組的貝在鍶海水（高濃度）培養(yǎng)一天，之后用正常海水徹底置換鍶海水并繼續(xù)培養(yǎng)六天，將貝殼制樣后用透射電鏡對斷面成像，箭頭所指的線是鍶元素形成的，圓圈內(nèi)進(jìn)行了元素分析驗(yàn)證；E，注射30μgPif基因的dsRNA并做相同處理的實(shí)驗(yàn)組貝殼珍珠層斷面的透射電鏡成像。同樣，圓圈內(nèi)用元素分析檢測到了高濃度鍶元素。B，C標(biāo)尺：10μm；D，E標(biāo)尺：2μm。有越來越多的基質(zhì)蛋白相繼利用各種手段被鑒定出來，研究者發(fā)現(xiàn)有一些基質(zhì)蛋白具有相似的特征，而另一些則差異較大。這與預(yù)期是相符的，礦化結(jié)構(gòu)的多樣性和復(fù)雜性側(cè)面反映出其對應(yīng)的調(diào)控蛋白也很可能是復(fù)雜多樣的。根據(jù)已有研究，基質(zhì)蛋白可以簡單按照理化性質(zhì)和氨基酸特征進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，此外還需要結(jié)合基質(zhì)蛋白在貝殼的不同礦化結(jié)構(gòu)中的分布、等電點(diǎn)差異等信息。按照這一分類標(biāo)準(zhǔn)，我們可以簡要將基質(zhì)蛋白分為以下幾類：1）酸性基質(zhì)蛋白。主要的代表性蛋白有Caspartin(Marinetal.,2005),Aspein(Tsukamotoetal.,2004)、Asp-rich(Shinetal.,2000)家族的蛋白、MSP-1(SarashinaandEndo,2001)、MSP-2(HasegawaandUchiyama,2005)、Prismalin-14(Suzukietal.,2004


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