養(yǎng)豬業(yè)中多種傳染性疾病嚴(yán)重影響著豬的育種進(jìn)程和生產(chǎn)效益,帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。如何防治病毒感染和傳播是近些年來一直被關(guān)注的熱點(diǎn)問題。常規(guī)的疫苗接種和藥物的長期使用,使得具有較強(qiáng)變異能力的病毒進(jìn)行不斷變異,最終導(dǎo)致病毒防治變得更加困難,因此無法從根本上解決病毒的傳播。利用遺傳手段修飾宿主關(guān)鍵基因,通過抗病育種策略培育抗病豬是預(yù)防疾病傳播的一種有效方法,也是目前的研究熱點(diǎn),如現(xiàn)有的抗藍(lán)耳病豬和抗豬瘟病毒豬都達(dá)到了良好的抗病效果。這種方法最關(guān)鍵的是尋找宿主體內(nèi)有效的抗病基因,然而已知的有效基因很少,如何去挖掘更多的有效基因給科研工作者帶來了極大的挑戰(zhàn)。近幾年,快速發(fā)展的基因組編輯技術(shù)CRISPR/Cas9能夠從分子、細(xì)胞或胚胎水平對細(xì)胞或個體進(jìn)行操控。CRISPR高通量篩選結(jié)合基因功能缺失能夠有效地挖掘病毒抗性的關(guān)鍵基因。選擇活性高和脫靶低的sg RNA對CRISPR高通量篩選的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。因此,本研究首先探討了sg RNA的活性和特異性,對長度分別為17、18、19和20 nts的sg RNA活性和特異性進(jìn)行了評估。軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)長度為20 nts的sg RNA潛在的脫靶位點(diǎn)數(shù)量最少,因... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：147 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

CRISPR系統(tǒng)在適應(yīng)性免疫中的機(jī)制（Hsuetal.2014）

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2019屆博士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文4構(gòu)域切割，導(dǎo)致雙鏈斷裂(Double-StrandedBreak,DSB)（Gasiunasetal.2012）（圖1-2）。為了更加便于應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，研究人員開發(fā)了一種嵌合的guideRNA(gRNA)，同時(shí)含有crRNA和tracrRNA的所有必需序列，從而簡化了CRISPR/Cas9的操作系統(tǒng)（Jineketal.2012）。圖1-2CRISPR/Cas9介導(dǎo)的DNA切割原理（Zhangetal.2014）Fig.1-2SchematicofCRISPR/Cas9-mediatedDNAcleavage.CRISPR/Cas9產(chǎn)生DSB會激發(fā)細(xì)胞DNA修復(fù)過程，主要包括非同源末端連接(Non-HomologousEndJoining,NHEJ)（DerianoandRoth2013）介導(dǎo)的DNA修復(fù)和同源重組(Homology-DirectedRepair,HDR)介導(dǎo)的DNA精準(zhǔn)修復(fù)（HartlerodeandScully2009）。NHEJ介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)能夠使斷開的雙鏈連接在一起，并在斷裂位點(diǎn)處產(chǎn)生小的插入(Insertion)和缺失(Deletion)突變(Indels)（Jineketal.2013,Congetal.2013）。這些Indels突變能夠破壞和廢除靶基因或基因組重要元件的功能，借助這個功能研究人員制備了多種遺傳修飾動物個體（Crispoetal.2015,HashimotoandTakemoto2015,Wangetal.2015b,Wangetal.2016,Ikedaetal.2017）。HDR介導(dǎo)的DNA精準(zhǔn)修復(fù)需要含有同源供體DNA序列作為修復(fù)模板。因此，比NHEJ介導(dǎo)的DNA修復(fù)復(fù)雜的多（JamesM.Daley2013,Wangetal.2015a）（圖1-3）。基因組的精準(zhǔn)修復(fù)，如點(diǎn)突變、編碼區(qū)(CodingDNASequence,CDS)替換、報(bào)告基因

CRISPR誘導(dǎo)的NHEJ和HDR（Guitartetal.2016）


本文編號：3356943