本文關(guān)鍵詞：牙鲆原始生殖細(xì)胞的起源、增殖和遷移以及高溫雄性化的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：牙鲆Olive flounder(Paralichthys olivaceus)是我國重要的海水經(jīng)濟養(yǎng)殖品種,具有極高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。牙鲆在養(yǎng)殖過程中雌性生長速度顯著高于雄性,生產(chǎn)中,人們希望降低雄性的比例獲得更高的經(jīng)濟效益。溫度是影響魚類性別分化重要的環(huán)境因子之一。高溫可以導(dǎo)致鲆鰈類雄性比例顯著增多,甚至達(dá)到100%雄性。因此研究溫度對牙鲆性別分化的影響及其內(nèi)在的機制對于豐富魚類性別分化理論、完善魚類生殖發(fā)育調(diào)控機制具有重要的意義。本研究克隆了牙鲆生殖細(xì)胞標(biāo)記基因dnd并研究了其在胚胎發(fā)育和配子發(fā)生過程中的表達(dá)模式;克隆了基質(zhì)細(xì)胞衍生因子sdf-1和趨化因子cxcr4,并研究了其在胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)模式,比較了在不同溫度處理條件下,其表達(dá)量的變化;比較了XX牙鲆在雄激素(17α-甲基睪酮)和高溫(28℃)處理條件下,誘導(dǎo)率情況,全長情況,生殖細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量增殖變化,生殖細(xì)胞標(biāo)記基因(dnd)和雄性高表達(dá)基因(amh)在性分化過程中的表達(dá)量變化;比較了高溫處理條件下,性分化過程中,抗繆勒氏管激素、雌二醇、睪酮和甲狀腺激素的含量變化。主要研究結(jié)果如下:1)牙鲆生殖質(zhì)是母源性的,Podnd基因能夠用于標(biāo)記PGCs在胚胎發(fā)育過程中的發(fā)生遷移模式;牙鲆PGCs起源和遷移模式和斑馬魚、大菱鲆相似;2)雄激素(17α-甲基睪酮),高溫(28℃)在幼魚全長1.2-1.3cm之間進行處理,均可以誘導(dǎo)XX牙鲆幼魚雄性化:XX牙鲆雌性率為94.44%;雄激素處理,誘導(dǎo)率達(dá)到92.31%,同時顯著抑制了幼魚的生長;而高溫在誘導(dǎo)雄性化的過程中,誘導(dǎo)率達(dá)到95.24%,較對照組而言,全長無顯著性差異;3)牙鲆sdf-1和cxcr4主要在原腸期和體節(jié)期表達(dá),符合PGCs遷移運動發(fā)生的時期特點,且在不同溫度處理下,上述兩個因子的表達(dá)量有顯著變化,可能參與了其遷移調(diào)控的過程;4)在性分化過程中,未分化的性腺朝著雌性和雄性分化時,生殖細(xì)胞的數(shù)量和增殖方式呈現(xiàn)二態(tài)性,朝著雌性分化的群體生殖細(xì)胞數(shù)量顯著高于雄性。同時,雄性的凋亡顯著高于雌性,且雄性的凋亡呈現(xiàn)片狀帶型特征,雌性是點狀零散型的特征,可能凋亡特點的不同參與了生殖細(xì)胞數(shù)量的差異;5)在性分化過程中,生殖細(xì)胞標(biāo)記基因dnd,雄性高表達(dá)基因amh呈現(xiàn)出明顯的性別二態(tài)性,雌性主導(dǎo)群體的dnd表達(dá)量顯著高于雄性主導(dǎo)群體,同時,雌性主導(dǎo)群體的amh表達(dá)量顯著低于雄性主導(dǎo)群體。
【關(guān)鍵詞】：牙鲆(Paralichthys olivaceus) 性別分化 高溫 雄激素 分子機制
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(海洋研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S917.4
【目錄】：

• 致謝4-5
• 摘要5-7
• ABSTRACT7-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-32
• 1.1 魚類原始生殖細(xì)胞胚胎期的發(fā)生發(fā)育研究進展15-18
• 1.1.1 魚類PGCs的形態(tài)組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和電鏡超微結(jié)構(gòu)特征15-16
• 1.1.2 魚類PGCs標(biāo)記基因及技術(shù)研究進展16
• 1.1.3 魚類PGC(s)的起源16-17
• 1.1.4 魚類PGC(s)遷移路線及機制研究進展17-18
• 1.1.5 環(huán)境因子對魚類PGCs遷移的影響18
• 1.2 硬骨魚類性腺的分化和發(fā)育研究進展18-26
• 1.2.1 硬骨魚類性腺分化的判斷標(biāo)準(zhǔn)研究進展19-21
• 1.2.1.1 性腺分化類型19-20
• 1.2.1.2 性腺分化的時間20
• 1.2.1.3 性別雌雄判斷的標(biāo)志20-21
• 1.2.2 魚類性別分化與日齡和全長的關(guān)系21
• 1.2.3 抗繆勒氏管激素在性別分化中的作用研究21-23
• 1.2.4 生殖細(xì)胞在性別分化過程中的作用23-24
• 1.2.5 性別分化過程中相關(guān)基因的研究進展24-26
• 1.2.5.1 生殖細(xì)胞標(biāo)記基因dnd24
• 1.2.5.2 P450arom24-25
• 1.2.5.3 foxl25-26
• 1.2.5.5 sox926
• 1.3 人工誘導(dǎo)魚類性腺的分化26-29
• 1.3.1 人工誘導(dǎo)魚類性分化的方式26-29
• 1.3.1.1 外源激素誘導(dǎo)魚類性分化27
• 1.3.1.2 高溫誘導(dǎo)魚類雄性化27-28
• 1.3.1.3 藥物誘導(dǎo)魚類性腺的分化28-29
• 1.3.2 細(xì)胞凋亡與性別分化的關(guān)系29
• 1.4 牙鲆胚胎發(fā)育及性分化的研究進展29-30
• 1.4.1 牙鲆概述29
• 1.4.2 牙鲆胚胎發(fā)育及性分化研究進展29-30
• 1.5 本研究的意義及目的30-32
• 第二章 牙鲆原始生殖細(xì)胞的起源、增殖和遷移及在成熟性腺中的表達(dá)模式32-54
• 2.1 研究背景32-33
• 2.2 材料與方法33-40
• 2.2.1 實驗材料33
• 2.2.2 主要儀器和試劑33-34
• 2.2.2.1 主要儀器33
• 2.2.2.2 主要試劑33-34
• 2.2.3 牙鲆原始生殖細(xì)胞標(biāo)記基因dnd的克隆34-36
• 2.2.3.1 總RNA提�。≧NA提取試劑盒）34
• 2.2.3.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成34
• 2.2.3.3 dnd部分片段的獲得34-35
• 2.2.3.4 RACE獲得dnd c DNA全長序列35-36
• 2.2.4 dnd序列分析及進化樹構(gòu)建36
• 2.2.5 dnd在牙鲆胚胎發(fā)育期及成魚各組織的熒光定量檢測36-37
• 2.2.6 dnd在牙鲆胚胎發(fā)育期及性腺的原位檢測37-40
• 2.2.6.1 Podnd正義和反義探針合成37-38
• 2.2.6.2 切片原位雜交38-39
• 2.2.6.3 胚胎整體原位雜交39-40
• 2.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計40
• 2.3 結(jié)果40-51
• 2.3.1 dnd基因序列和進化關(guān)系分析40-42
• 2.3.2 牙鲆dnd成魚各組織和胚胎發(fā)育時序表達(dá)情況42-44
• 2.3.3 牙鲆dnd基因在性腺中的表達(dá)定位44-46
• 2.3.4 牙鲆dnd基因在胚胎發(fā)育過程中的定位46-51
• 2.4 討論51-54
• 2.4.1 牙鲆dnd基因的克隆和序列特征分析51-52
• 2.4.2 牙鲆dnd基因的成魚各組織及在成熟性腺中的定位模式檢測52
• 2.4.3 牙鲆dnd基因在胚胎期的表達(dá)模式分析52
• 2.4.4 牙鲆原始生殖細(xì)胞的遷移模式分析52-54
• 第三章 雄激素誘導(dǎo)牙鲆性分化過程中生殖細(xì)胞數(shù)量變化及相關(guān)基因差異表達(dá)研究54-74
• 3.1 研究背景54-55
• 3.2 材料與方法55-57
• 3.2.1 實驗材料55
• 3.2.2 實驗設(shè)計和取樣55-56
• 3.2.3 主要儀器和試劑56
• 3.2.3.1 主要儀器56
• 3.2.3.2 主要試劑56
• 3.2.4 性分化關(guān)鍵期性腺組織學(xué)觀察56
• 3.2.5 性分化關(guān)鍵期基因dnd和amh熒光定量PCR檢測56-57
• 3.2.6 ELISA法檢測激素含量57
• 3.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計57
• 3.3 結(jié)果57-71
• 3.3.1 牙鲆對照組和雄激素誘導(dǎo)組誘導(dǎo)率統(tǒng)計57-58
• 3.3.2 牙鲆性分化關(guān)鍵期對照組和雄激素誘導(dǎo)組幼魚全長比較58-59
• 3.3.3 在性分化關(guān)鍵期，對照組和雄激素誘導(dǎo)組生殖細(xì)胞形態(tài)、分布和數(shù)量變化及增殖方式比較59-65
• 3.3.3.1 在性分化關(guān)鍵期，表型雌雄的生殖細(xì)胞形態(tài)及分布變化59-64
• 3.3.3.2 在性分化關(guān)鍵期中，表型雌雄的生殖細(xì)胞增殖規(guī)律64-65
• 3.3.4 性分化完成后，對照組和雄激素組，表型雌雄性腺組織學(xué)比較65-68
• 3.3.5 牙鲆性分化關(guān)鍵期相關(guān)基因的表達(dá)量變化68-71
• 3.3.5.1 dnd基因在性腺分化過程中的表達(dá)變化68-69
• 3.3.5.2 amh基因在各組織中的表達(dá)情況69-70
• 3.3.5.3 amh基因在性腺分化過程中的表達(dá)情況70-71
• 3.3.6 牙鲆性分化關(guān)鍵期抗繆勒氏管激素變化71
• 3.4 討論71-73
• 3.4.1 外源添加17α-甲基睪酮誘導(dǎo)雄性化71-72
• 3.4.2 雄激素誘導(dǎo)對幼魚生長的抑制作用72
• 3.4.3 amh基因和抗繆勒氏管激素的作用72-73
• 3.5 小結(jié)73-74
• 第四章 高溫影響牙鲆原始生殖細(xì)胞遷移及雄性化過程中生殖細(xì)胞數(shù)量變化及相關(guān)基因差異表達(dá)74-109
• 4.1 研究背景74-76
• 4.2 高溫影響牙鲆sdf-1 和cxcr4表達(dá)量的變化76-87
• 4.2.1 材料與方法76-78
• 4.2.1.1 實驗設(shè)計及取樣76
• 4.2.1.2 主要儀器和試劑76
• 4.2.1.3 牙鲆分泌和趨化因子sdf-1/cxcr4基因克隆76-77
• 4.2.1.4 序列分析及進化樹構(gòu)建77
• 4.2.1.5 實時熒光定量PCR檢測77
• 4.2.1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計77-78
• 4.2.2 結(jié)果78-86
• 4.2.2.1 牙鲆sdf-1 和cxcr4基因克隆和序列分析78-83
• 4.2.2.1.1 sdf-1 基因克隆和序列分析78-80
• 4.2.2.1.2 cxcr4基因克隆和序列分析80-83
• 4.2.2.2 牙鲆sdf-1 和cxcr4基因的組織特異性83-84
• 4.2.2.3 不同溫度處理條件下，sdf-1 和cxcr4的表達(dá)變化84-86
• 4.2.3 討論86-87
• 4.3 高溫誘導(dǎo)牙鲆雄性化過程中生殖細(xì)胞數(shù)量和基因表達(dá)差異研究87-109
• 4.3.1 材料與方法87-88
• 4.3.1.1 實驗材料87
• 4.3.1.2 實驗設(shè)計和取樣87
• 4.3.1.3 主要儀器和試劑87
• 4.3.1.4 凋亡檢測87-88
• 4.3.1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計88
• 4.3.2 結(jié)果88-106
• 4.3.2.1 對照組和高溫誘導(dǎo)組的誘導(dǎo)率及全長比較88-89
• 4.3.2.2 性腺分化關(guān)鍵期性腺組織切片觀察89-106
• 4.3.2.2.1 性分化關(guān)鍵期，對照組和高溫誘導(dǎo)組的生殖細(xì)胞形態(tài)和分布變化89-96
• 4.3.2.2.2 性分化關(guān)鍵期，對照組和高溫誘導(dǎo)組生殖細(xì)胞數(shù)量變化比較。96-97
• 4.3.2.2.3 性腺分化完成后，對照組和高溫誘導(dǎo)組的性腺組織學(xué)比較97-101
• 4.3.2.2.4 凋亡相關(guān)檢測101-102
• 4.3.2.2.5 性腺分化關(guān)鍵期，基因dnd和amh的表達(dá)情況檢測102-103
• 4.3.2.2.6 性分化過程中，對照組和高溫誘導(dǎo)組相關(guān)激素含量的變化103-106
• 4.3.3 討論106-108
• 4.3.3.1 性別分化過程中，，生殖細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)性別二態(tài)性106-107
• 4.3.3.2 凋亡在精巢和卵巢中呈現(xiàn)不同的分布特征107
• 4.3.3.3 amh和激素在高溫雄性化中的作用107-108
• 4.3.4 小結(jié)108-109
• 第五章 結(jié)論與展望109-111
• 5.1 主要研究結(jié)論109-110
• 5.2 展望110-111
• 參考文獻(xiàn)111-128
• 作者簡介128-129
• 博士期間發(fā)表和完成的論文129

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